腸球菌esp基因與萬(wàn)古霉素耐藥的相關(guān)性研究

王國(guó)富 吳利先 薛士鵬

腸球菌長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為致病力較低而未引起重視，但近年來(lái)，腸球菌屬條件致病菌所致感染的發(fā)生率持續(xù)升高，尤其在原有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病及機(jī)體免疫力降低時(shí)，極易侵入體內(nèi)或易位，導(dǎo)致局部或全身重癥感染，給臨床治療帶來(lái)困難。目前，腸球菌已成為醫(yī)院感染的主要致病菌，又容易形成生物被膜，臨床上細(xì)菌生物被膜可形成于各種生物置入材料表面及體內(nèi)黏膜表面，具有極強(qiáng)的耐藥性及免疫逃避性，是造成臨床慢性感染的主要原因之一。腸球菌表面蛋白(enterococca surface protein，ESP)是由esp基因所編碼的。與腸球菌生物被膜的形成及免疫逃逸有關(guān)［1］，而生物被膜的形成及免疫逃逸是細(xì)菌耐藥株出現(xiàn)和傳播的必要風(fēng)險(xiǎn)因子［2］。因此，了解esp基因在腸球菌在臨床的流行情況，分析esp基因的存在狀況與腸球菌之間耐藥的相關(guān)性就顯得非常必要。對(duì)此本研究對(duì)從醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)感染患者分離得到的94株腸球菌進(jìn)行esp基因與萬(wàn)古霉素耐藥的相關(guān)性研究，結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床菌株 94株腸球菌來(lái)自醫(yī)院7個(gè)ICU病房患者的臨床標(biāo)本［3］。藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC2592和糞腸球菌ATCC29212為本室保存。

1.2 試劑材料 萬(wàn)古霉素和替考拉林標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)禮來(lái)公司。地高辛標(biāo)記的探針檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。用于屎腸球菌和糞腸球菌esp基因擴(kuò)增的2對(duì)引物［4，5］由上海生工合成。屎腸球菌esp基因的引物，P1:5’-TTGCTAAT-GCAGTCCACGA CC-3’和 P2:5’-GCGTCAACACTIGCATTGCCGA-3’;糞腸球菌esp基因的引物P1:5’-GTGTGGGTGTTGCATCAGTATT-3’和 P2:5’-CATACTGGGCCAATC GTTCATC-3’。

1.3 方法

1.3.1 菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林MIC測(cè)定和耐藥性判定按照NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，測(cè)定94株菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林的MIC值，按照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)對(duì)耐藥性進(jìn)行判斷。

1.3.2 腸球菌esp基因分布的檢測(cè) 使用參照文獻(xiàn)［6］的高特異性菌落雜交法。具體步驟為將尼龍膜剪切后放置于培養(yǎng)腸球菌的BHI平板表面，然后用96孔接種器將增菌培養(yǎng)后的腸球菌接種于尼龍膜表面培養(yǎng)過(guò)夜。用溶菌酶、NaOH、氯仿和乙醇處理，使細(xì)菌DNA結(jié)合于膜表面，并置于4℃的冰箱保存?zhèn)溆?。用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測(cè)序，保證獲得正確的序列。采用地高辛標(biāo)記試劑盒提供的方法標(biāo)記探針，獲得檢測(cè)esp基因的探針，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行雜交和檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 94株腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林的耐藥性 屎腸球菌和糞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林的耐藥率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。屎腸球菌的耐藥率明顯高于糞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林的耐藥率。

表1 糞腸球菌與屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林的抗菌敏感性比較(例，%)

2.2 esp基因的分布與萬(wàn)古霉素耐藥的相關(guān)性 試驗(yàn)對(duì)94株腸球菌(其中糞腸球菌63株，屎腸球菌31株)的esp基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示63株糞腸球菌中有24株(38.1%)esp基因?yàn)殛?yáng)性。結(jié)合耐藥檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林耐藥和中介菌株esp基因均為陽(yáng)性。而31株屎腸球菌中有13株(41.9%)esp基因?yàn)殛?yáng)性。結(jié)合耐藥檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這13株中同樣包括了對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林耐藥和中介的屎腸球菌菌株。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 esp基因在細(xì)菌中的分布(例，%)

表3 esp基因與萬(wàn)古霉素耐藥相關(guān)性比較

3 討論

近年來(lái)，臨床上多重耐藥G+菌感染的形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)重，其中腸球菌(Enterococcus)是主要的病原菌之一，其感染已成為醫(yī)院內(nèi)感染病原菌的第2位。隨著對(duì)腸球菌致病機(jī)制的逐步深入，發(fā)現(xiàn)腸球菌與多種置入醫(yī)療器材如導(dǎo)尿管、靜脈插管和人工瓣膜所引起的生物被膜相關(guān)感染有關(guān)，而esp基因編碼的ESP蛋白在腸球菌生物被膜形成中起了重要的作用。萬(wàn)古霉素一度被認(rèn)為是臨床抗感染的最后一道防線(xiàn)，但目前各個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道出現(xiàn)了耐萬(wàn)古霉素的腸球菌菌株，成了臨床治療的一大難題。為了解本地區(qū)腸球菌的耐藥趨勢(shì)以及esp基因與萬(wàn)古霉素耐藥的相關(guān)性，本研究將ICU分離到的94株腸球菌進(jìn)行了萬(wàn)古霉素和替考拉的耐藥性檢測(cè)。結(jié)果在糞腸球菌中檢出4株(6.35%)替考拉林耐藥菌株;檢出3株(4.76%)萬(wàn)古霉素耐藥菌株，而屎腸球菌檢出5株(16.1%)替考拉林耐藥菌株，萬(wàn)古霉素耐藥菌株7株(22.58%)，糞腸球菌耐藥率明顯低于屎腸球菌對(duì)替考拉林和萬(wàn)古霉素的耐藥率，這一結(jié)果比其他醫(yī)院報(bào)道的結(jié)果要高［7］。主要的原因可能是本研究檢測(cè)的細(xì)菌是來(lái)自重癥監(jiān)護(hù)病房，這里的患者一般均有基礎(chǔ)疾病，需要長(zhǎng)期使用抗生素所至。

本研究還對(duì)同批94株腸球菌進(jìn)行了esp基因檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示63株糞腸球菌中有24株菌的esp基因?yàn)殛?yáng)性。31株屎腸球菌中13株菌esp基因陽(yáng)性，比國(guó)外報(bào)道相對(duì)要低。在所有對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉林耐藥和中介的糞腸球菌和屎腸球菌esp基因均為陽(yáng)性。這說(shuō)明esp基因分布與腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的關(guān)系非常密切。這可能與Esp蛋白有獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)，可以改變蛋白表達(dá)形式，而這種細(xì)胞壁表面的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使腸球菌能避過(guò)免疫宿主的阻擋，在強(qiáng)大的抗菌藥物選擇性壓力下繼續(xù)生存，而且陽(yáng)性株耐藥的esp比陰性株esp更易傳播。兩外還與esp基因與細(xì)菌生物被膜形成有關(guān)。在生物被膜的保護(hù)下，細(xì)菌可以相互交流，協(xié)同生長(zhǎng)，形成細(xì)菌微環(huán)境，而不易被殺滅［8］。生物被膜的產(chǎn)生使生物被膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性比浮游細(xì)菌增加了10～1000倍，更能夠抵抗機(jī)體的免疫效應(yīng)和抗生素的殺菌作用。由此得出腸球菌esp基因的存在與細(xì)菌耐萬(wàn)古霉素密切相關(guān)，從而esp基因的存在就為腸球菌耐藥性監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)有用的分子標(biāo)志物，有助于將Esp蛋白作為臨床抗腸球菌屬治療的一個(gè)新靶位，達(dá)到控制腸球菌感染和耐藥逐漸上升的目的。

［1］Toledo-Arana A，Valle J，Solano C，et a1.The Enterococcus surface protein，ESP，is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation.Appl Environ Microbiol，2001，67(10):4538-4545.

［2］Coque TM，Willems R，Canton R，et a1.High occurrence of esp among ampicillin-resistant and vancomycin-susceptible Enterococcus faecium clones from hospitalized patients.J Antimicrob Chemother，2002，50(8):1035-1038.

［3］吳利先，王國(guó)富，鄭行萍.重癥監(jiān)護(hù)病房的腸球菌種類(lèi)及其耐藥性分析.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，6(10):28-30.

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［7］王德，蘇琪，王麗.184株腸球菌的臨床分布及耐藥性分析.中國(guó)抗生素雜志，2010，35(2):160，S1-S3.

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