攜帶hHCN4基因重組腺病毒載體體外轉染大鼠BMSCs的實驗研究

佟玉娜，王高頻

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧錦州 121000

多年來，因為電子起搏器的不足如缺乏對神經(jīng)體液的自主調(diào)節(jié)等，構建生物起搏器逐漸進入人們的視野。目前超極化激活及環(huán)化核苷酸門控陽離子通道基因(HCN)具有起搏活動所必須的獨特特征備受關注。研究表明HCN4在竇房結細胞起搏離子流中起著核心、特異性作用[1-2]。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)體外培養(yǎng)擴增快、易于外源基因的導入與表達，并具有多向分化潛能，可向成骨、成脂細胞等方向分化，成為理想基因治療的種子細胞[3-6]。由于HCN4是維持竇房結起搏細胞電生理功能的特異性基因，本研究則用攜帶hHCN4基因的重組腺病毒載體體外轉染大鼠BMSCs，通過RT-PCR和Western Blot方法檢測目的基因在BMSCs中有mRNA和蛋白水平的表達，證實hHCN4基因在BMSCs中能夠表達，為進步證實攜帶hHCN4基因的BMSCs具有起搏功能提供依據(jù)，繼而將攜帶hHCN4基因的BMSCs作為生物起搏細胞，為基因和細胞相結合治療緩慢性心律失常構建生物起搏器奠定基礎。

材料和方法

1 實驗動物 200~250 g健康2個月大鼠10只(雌雄不拘)，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2 主要試劑和儀器 重組腺病毒載體Ad-hHCN4-IRES/eGFP(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨科重點實驗室構建)；LipofectamineTM 2000(Invitrogen)；DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司)、胎牛血清(Hyclone公司)；Trizol RNA提取液(Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(Fermentas)；RIPA(碧云天生物技術研究所)；大鼠抗人HCN4單克隆抗體(Abcam公司)；辣根過氧化物酶標記兔抗大鼠IgG二抗(碧云天生物技術研究所)。熒光顯微鏡(Olympus)、梯度PCR儀(Thermo)、Western Blot電泳儀、電泳槽、轉膜儀(Bio-Rad)、Labworks凝膠圖像分析系統(tǒng)(UVP)。

3 BMSCs的分離、培養(yǎng)及傳代 取200~250 g健康2個月大鼠，斷頸處死，75%乙醇浸泡15 min，無菌條件下取大鼠股骨和脛骨，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗干凈，切除兩端干骺端，DMEM培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，200目篩網(wǎng)過濾，2 000 r/min離心20 min，去除上清液，加含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種于塑料培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下行原代培養(yǎng)(P0代)。3 d后更換培養(yǎng)液，換液前PBS沖洗2次，以去除未貼壁的造血細胞，加含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d換液一次，進一步去除未貼壁細胞，待細胞匯合80%以上時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。培養(yǎng)至第3代(P3代)以上用于轉染并拍照。

4 重組腺病毒載體轉染BMSCs 用已經(jīng)構建成功的重組腺病毒載體Ad-hHCN4-IRES/eGFP體外轉染大鼠BMSCs。轉染采用LipofectamineTM 2000試劑盒，取P3代生長良好的BMSCs。用無抗生素的培養(yǎng)液將細胞接種于6孔板中，接種密度為(0.5~2)×105。第2天，細胞達到80%~90%融合。換液，加入2 ml不含抗生素的培養(yǎng)液。將4.0 μg質(zhì)粒pAV-hHCN4-IRES/eGFP用Opti-MEMⅠ培養(yǎng)液稀釋至50 μl，輕輕混勻；取10 μl LipofectamineTM 2000滴入40 μl的Opti-MEMⅠ培養(yǎng)液中，室溫孵育5 min。將稀釋的質(zhì)粒和稀釋的Lipofectamine TM 2000混合，輕輕混勻，室溫下孵育20 min。將此100 μl的混合液加入細胞孔中，37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5~6 h后，更換含血清的新鮮培養(yǎng)液。24~48 h后在熒光顯微鏡下依據(jù)綠色熒光判斷質(zhì)粒是否轉染至BMSCs中。

5 RT-PCR檢測轉染細胞hHCN4基因mRNA的表達 將未轉染和轉染Ad-hHCN4-IRES/eGFP 48 h后的BMSCs消化并離心收集，按照Trizol說明書提取總RNA進行逆轉錄反應。以cDNA產(chǎn)物為模板、β-actin為內(nèi)參，進行RT-PCR，所用引物見表1。hHCN4基因擴增條件為94 ℃、45 s，63.6℃、45 s，72 ℃、1 min，共34個循環(huán)。β-actin擴增條件為94 ℃、45 s，55.3 ℃、45 s，72 ℃、1 min，共 34 個循環(huán)。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相并分析結果。

6 Western Blot檢測hHCN4基因蛋白的表達PBS沖洗細胞2遍，加入蛋白裂解液，冰上靜置30 min，然后將此混合液轉移到1.5 ml離心管中，4 ℃、12 000 r/min×30 min離心，以RIPA蛋白提取試劑分別提取轉染Ad-hHCN4-IRES/eGFP后和未經(jīng)轉染處理的BMSCs的細胞總蛋白。一抗hHCN4和β-actin均按1∶1 000倍稀釋；二抗采用辣根過氧化物酶標記兔抗大鼠IgG抗體，按1∶5 000倍稀釋。用ECL試劑盒顯色，有目的蛋白表達的條帶呈黑色，各條帶掃描后采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析。

表1 RT-PCR目的基因和對照基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of target and control genes for PCR

結 果

1 BMSCs形態(tài)學特點 剛分離出的P0代細胞呈圓形，大小不等，細胞膜完整光滑，其中雜細胞較多；8~10 h后逐漸貼壁生長，24 h后基本貼壁，48 h后多數(shù)為成纖維樣的梭形細胞；72 h后首次換液，大部分細胞已伸展呈多角形；7~10 d細胞集落逐漸增多并基本達90%以上融合；經(jīng)1∶2傳代后，造血細胞基本消失，貼壁細胞體積較大，生長迅速，大多為長梭型。P3代后細胞大小趨于均勻，以梭形細胞為主，部分小規(guī)則，細胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定。見圖1。

2 Ad-hHCN4-IRES/eGFP轉染大鼠BMSCs 轉染24 h后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光(圖2)，根據(jù)綠色熒光陽性細胞百分率判斷腺病毒介導的基因轉染效率。有細胞綠色熒光表達說明部分細胞已經(jīng)成功轉染并表達目的基因。調(diào)整轉染后細胞密度在(100~200)×105/L之間，0.25%胰酶消化，血球計數(shù)板普通視野下計細胞數(shù)A，換熒光下相同視野計熒光細胞數(shù)a，計算轉染效率[轉染效率(%)=a/A×100%]。轉染24 h后轉染效率約為20%~30%。

3 轉染Ad-hHCN4-IRES/eGFP大鼠BMSCs hHCN4 mRNA檢測 轉染72 h后 提取BMSCs總RNA，用RT-PCR法檢測hHCN4 mRNA的表達。結果顯示，轉染后BMSCs可檢測出hHCN4 mRNA，而未轉染的BMSCs未能檢測到hHCN4 mRNA，見圖3。

4 轉染Ad-hHCN4-IRES/eGFP大鼠BMSCs hHCN4蛋白表達Westem Blot檢測 結果顯示，Ad-hHCN4-IRES/eGFP轉染組BMSCs可檢出hHCN4蛋白表達，而未轉染組的BMSCs未檢測到hHCN4蛋白表達，見圖4。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs) A： P0代(×100)； B： 10 h后貼壁(×200)； C： P3代(×100)Fig.1 Bone marrow mesenchymal stem cells A： Primary generation; B： After 10 h adherent; C: Third-generation(×100)

圖2 轉染重組腺病毒的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞見綠色熒光蛋白表達(×100)Fig.2 Expression of green fluorescence protein in rat bone marrow mesencyhmal stem cells after recombinant adenovirus transfection

圖3 RT-PCR檢測轉染后hHCN4-mRNA的表達Fig.3 RT-PCR showing expression of trans-fected hHCN4 mRNA M: DGL600 Marker； 1, 2: After trans-fection； 3, 4: Untransfected

圖4 Western blot 檢測轉染后hHCN4蛋白的表達Fig.4 Western blot showing expression of transfected hHCN4 protein 1, 3: After transfection; 2, 4: Untran-sfected

討 論

Brown，Difrancesco[7]在竇房結起搏活動中研究發(fā)現(xiàn)超級化激活環(huán)化核苷酸門控陽離子通道基因(hyperdarization activated cyclic nucleotide gated cation channed，HCN)具有超極化激活、鈉鉀離子通透、細胞內(nèi)cAMP調(diào)節(jié)、微弱的單通道電導及被細胞外銫特異性阻斷等特性，是起搏電流形成的分子基礎。HCN家族成員有4個，其中HCN1、HCN2及HCN4在心臟中表達。Xiao等[8]采用RTPCR法檢測竇房結和心房組織中HCNs的表達，結果示人竇房結組織中主要表達HCN4，占75%。心臟正常節(jié)律性跳動有賴于竇房結正常發(fā)放沖動以及完善的傳導系統(tǒng)。各種原因造成竇房結或房室結起搏細胞數(shù)量減少或功能衰退可進一步導致嚴重的心動過緩，引起竇房結功能障礙或房室傳導阻滯[9]。最新研究表明，HCN4的主要作用是使起搏的頻率維持在一定水平并隨著機體的不同生理狀態(tài)而對頻率進行調(diào)節(jié)[10]。因此，HCN4通道對竇房結潛在起搏活動的產(chǎn)生有至關重要的作用，成為目前最受關注的起搏備選基因[11]。

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)存在于骨髓腔中，是一類具有多項分化能力的干細胞，能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等中胚層細胞[12]。在其他一些動物實驗甚至臨床人體實驗中，并沒有觀察到BMSCs明顯的致嚴重室性心律失常的事件發(fā)生，提示BMSCs用于心臟移植具有較大的安全性[13]。2005年Beeres等[14]體外培養(yǎng)實驗顯示，人BMSCs能修復心肌傳導阻滯。由于BMSCs具有較多優(yōu)點：1)易獲取、傳代，對人體無害，不存在法律及倫理問題；2)免疫原性較低，不存在組織配型及免疫排斥問題；3)易于外源基因的導入和表達；4)具有多向分化潛能，已成為目前理想的基因治療靶細胞。

本實驗將攜帶hHCN4基因的重組腺病毒載體轉染大鼠BMSCs后的24~48 h觀察到部分BMSCs在熒光顯微鏡下可見綠色熒光顆粒，這說明含綠色熒光蛋白的重組腺病毒載體已成功轉染到BMSCs中并正常表達，通過綠色熒光蛋白的表達檢測轉染效率和研究轉染成功的細胞。更重要的是本實驗通過RT-PCR及Western Blot檢測法從mRNA和蛋白水平的表達證實通過轉染可使BMSCs表達hHCN4基因，進一步證實基因和細胞可融洽的結合以構建生物起搏器。

本實驗對細胞聯(lián)合基因治療進行了探索，取得了較為滿意的結果。轉染后BMSCs能夠表達hHCN4基因，但是攜帶hHCN4基因的BMSCs是否具有生理性起搏電流的特征？是否能與其共培養(yǎng)的心肌細胞產(chǎn)生通訊功能？是否能夠替代因病變失去起搏功能的細胞或傳導系統(tǒng)？我們將進行下一步研究，為構建生物起搏器提供更多的基礎依據(jù)，以期該領域的研究成果早日應用于臨床當中。

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