破布木果總多酚的超聲提取工藝研究

劉楓 張雪佳 李潔 田樹革

維藥破布木果為紫草科(Boraginaceae)植物破布木Cordia dichotoma Forst.f的干燥成熟果實(shí)，秋季果實(shí)采摘，曬干［1］。維吾爾醫(yī)認(rèn)為破布木果功效生濕生熱，成熟異常黑膽質(zhì)，潤(rùn)肺潤(rùn)喉，止咳化痰，清音止渴，通便利尿。主治干寒性或黑膽質(zhì)性疾病，如咽干喉燥，乃孜來(lái)性感冒，干咳頑痰，失音口渴，小便不利，大便不暢等［2］。破布木喜生于低海拔林中，云南、廣西、廣東、臺(tái)灣、福建有分布，印度、越南、澳大利亞?wèn)|北部、菲律賓等亦有分布［2］。

植物多酚是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚類化合物，又稱單寧，是植物的次生代謝產(chǎn)物，屬于天然有機(jī)化合物，在維管植物中的含量?jī)H次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，廣泛存在于植物的皮、根、葉、果中，含量可達(dá)20%［3］。植物多酚的多元酚結(jié)構(gòu)使其具有抗腫瘤、抗氧化、抗脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抗菌等多種理功能［4-7］，從而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、日用化學(xué)品以及保健品等領(lǐng)域［8-11］。

超聲波輔助提取是一種利用外力強(qiáng)化提取的新技術(shù)，具有提取時(shí)間短、提取效率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于天然香料、植物酶、中草藥活性成分等的提取［12］。超聲的空化作用對(duì)細(xì)胞膜的破壞有助于化合物的釋放與溶出，超聲波使提取液不斷振蕩，有助于溶質(zhì)擴(kuò)散，可以明顯地加速植物體和種子中有機(jī)成分的提取過(guò)程［13］。本文以破布木果作為原料，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，采用超聲輔助Folin-Ciocalteu比色法［14］測(cè)定破布木果中多酚含量，優(yōu)化了最佳提取條件，進(jìn)行了方法學(xué)考察，建立了破布木果總多酚含量的分析方法，為破布木果的開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司GBCCintra-40型);AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);TGL-16B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);B-260型水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);AK-1000A型500克搖擺式中藥粉碎機(jī)(溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司)。

1.2 材料

沒(méi)食子酸對(duì)照品(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，含量:99%);破布木果來(lái)自新疆麥迪森維藥有限責(zé)任公司飲片廠。經(jīng)高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后成細(xì)粉，過(guò)40目篩，即得。無(wú)水碳酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、乙醇等。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為自制蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多酚含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品10 mg，置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解，并定容至刻度，即得0.1 mg/ml的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥后的破布木果粉末1 g，置于錐形瓶中，加50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇50 ml，超聲提取30分鐘。離心，取上清液定容至50 ml的容量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 Folin—Cioealteu試劑(磷鉬鎢酸試液)的制備 稱取鎢酸鈉100.0 g和鉬酸鈉25.0 g，置于圓底燒瓶中用700 ml蒸餾水溶解，加入85%的磷酸50 ml和100 ml濃鹽酸充分混勻，小火加熱回流12小時(shí)，放冷，再加入150 g硫酸鋰，50 ml蒸餾水及0.2 ml雙氧水，加熱沸騰15分鐘至亮黃色，不得帶微藍(lán)和綠色，使雙氧水完全揮發(fā)，冷卻后用蒸餾水定容至1000 ml，過(guò)濾，于棕色瓶中避光儲(chǔ)存。

2.1.4 最大吸收波長(zhǎng)的掃描 取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 ml，置于25 ml比色管中，加入磷鉬鎢酸試液1 ml，再加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液2 ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，在40℃水浴恒溫30分鐘。以相應(yīng)的試劑為空白，在波長(zhǎng) 550～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明二者最大波長(zhǎng)均為746 nm，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為746 nm，見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的吸收譜圖

2.1.5 測(cè)定方法 準(zhǔn)確量取1 ml供試品溶液置25 ml干燥具塞比色管中，加入磷鉬鎢酸試液1 ml，再加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液2 ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，在40℃水浴恒溫30分鐘。為消除供試品溶液本身顏色的干擾，制作不加顯色劑的對(duì)照管。于746 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各吸光度值。

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與線性關(guān)系 精密吸取對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ml于10 ml干燥具塞比色管中，加入Folin—Cioealteu試劑1 ml，再加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸鈉溶液2 ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，在40℃水浴恒溫30分鐘，于746 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各吸光度值。以吸光度值A(chǔ)對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度C作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得 回 歸 方 程 為 A=145.2857C+0.03271，r=0.9995。沒(méi)食子酸在0.001～0.007 mg/ml范圍內(nèi)與其吸光度值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為0.003 mg/ml的對(duì)照品溶液，按2.1.5方法顯色后連續(xù)測(cè)定6次吸光度。計(jì)算RSD值為0.41%，結(jié)果表明該方法測(cè)定破布木果多酚精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于配制后的0、30、60、120、180、240 分鐘，按 2.1.5 方法顯色后連續(xù)測(cè)定6次吸光度。結(jié)果表明，供試品溶液在30分鐘內(nèi)較為穩(wěn)定，然后穩(wěn)定下降，因此，供試品溶液在配制完成后應(yīng)在30分鐘內(nèi)測(cè)定吸光度。

2.1.9 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的藥材粉末6份，按2.1.2所述方法制備，按2.1.5方法顯色后連續(xù)測(cè)定6次吸光度。計(jì)算RSD值為0.19%，結(jié)果表明該方法測(cè)定破布木果多酚重現(xiàn)性很好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)(3.23 mg/g)的樣品各0.5 g，共6份，精密加入沒(méi)食子酸對(duì)照品3.2 mg，按“2.1.2”所述方法制備，按“2.1.5”所述方法顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值為101.46%，結(jié)果表明該方法加樣回收率試驗(yàn)很好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 取破布木果粉末5份，每份1 g，以乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%，30%，50%，70%，90%，固定料液比為 1∶20，超聲時(shí)間30分鐘，超聲波功率400 W進(jìn)行超聲提取。以提取液中多酚含量為指標(biāo)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)破布木果總多酚提取率的影響

結(jié)果表明，其他條件不變時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚含量先升高后降低，并且當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，多酚質(zhì)量濃度最高為4.10 mg/g。所以選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.2.2 料液比對(duì)提取率的影響 取破布木果粉末5份，每份1 g，改變料液比，以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇為溶劑，超聲時(shí)間30分鐘，超聲波功率400 W進(jìn)行提取。以破布木果提取液中多酚含量為指標(biāo)，考察固料液比對(duì)提取率的影響。料液比對(duì)提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)破布木果總多酚提取率的影響

結(jié)果表明，其他條件不變時(shí)，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，多酚的得率最高，隨著溶劑量的增大，多酚含量呈上升趨勢(shì);但當(dāng)料液比在1∶30～1∶35時(shí)，提取液中多酚含量變化不大，所以選擇料液比為1∶30。

2.2.3 時(shí)間對(duì)提取率的影響 取破布木果粉末5份，每份1 g，以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇為提取溶劑，料液比為1∶30，超聲波功率400 W，超聲時(shí)間分別10、20、30、40、50 分鐘進(jìn)行提取。以提取液中多酚含量為指標(biāo)，考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。提取時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖5。

圖5 時(shí)間對(duì)破布木果總多酚提取率的影響

結(jié)果表明，其他條件不變時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液中多酚含量先升高后降低。當(dāng)提取時(shí)間為30分鐘時(shí)，多酚含量最高為2.81 mg，30分鐘后提取液中多酚含量反而降低，所以選擇提取時(shí)間為30分鐘。

2.2.4 功率對(duì)提取率的影響 取破布木果粉末4份，每份1 g，以體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇為提取溶劑，料液比為1∶30，超聲時(shí)間30分鐘，超聲波功率分別為200、300、400、500 W，超聲波作用時(shí)間為30 分鐘時(shí)進(jìn)行提取。以提取液中多酚含量為指標(biāo)，考察超聲功率對(duì)提取率的影響。超聲功率對(duì)提取率的影響見圖6。結(jié)果表明，其他條件不變時(shí)，隨著超聲功率增大，破布木果多酚提取率增大。所以選擇超聲功率為500 W。

圖6 功率對(duì)破布木果總多酚提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選破布木果總多酚超聲輔助提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了篩選更適宜的提取條件，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、超聲時(shí)間(C)和超聲功率(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，按照L9(34)正交表的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以優(yōu)化超聲波提取破布木果中總多酚的最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析結(jié)果見表2及表3。

表1 破布木果總多酚提取因素及水平表

表2 破布木果總多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 破布木果總多酚提取方差分析表

由表1、2、3可知，以破布木果多酚提取率為檢測(cè)指標(biāo)，各因素影響順序?yàn)镃＞A＞B＞D。時(shí)間對(duì)提取工藝有顯著性影響。優(yōu)化出破布木果中多酚提取最佳方案為A1B3C2D2，即提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇，料液比1∶35，提取時(shí)間30分鐘，超聲功率400 W。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取供試品3份，按照優(yōu)化工藝條件，重復(fù)3次試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果多酚提取率較高，平均為7.15 mg/g，比正交試驗(yàn)中最高提取率(7.01 mg/g)高，表明正交試驗(yàn)所確定的工藝條件為最佳工藝條件。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇溶液為最佳提取試劑，采用單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助提)取破布木果中總多酚，確定了最佳工藝條件，并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果證明，該工藝提取破布木果總多酚線路簡(jiǎn)單、提取率高、穩(wěn)定性好，因此為破布木果總多酚提取的工業(yè)生產(chǎn)提供了合理的依據(jù)。

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