基于MTT法的波棱瓜子抗肝纖維化用量初步研究

徐和 戴領(lǐng) 沈成英 韓晉 袁海龍

長(zhǎng)期以來(lái)，中藥臨床功用與質(zhì)量評(píng)控模式不相適宜，臨床應(yīng)用上中藥的品質(zhì)含量與臨床用量(質(zhì)—量)也是分離的，無(wú)論藥材中藥效成分量的高低，臨床用量卻未作出調(diào)整，導(dǎo)致臨床療效不確切或不穩(wěn)定。然而事實(shí)上，中藥質(zhì)—量是密不可分、相互依存的。中藥的用量不同于化學(xué)藥，化學(xué)藥用量與其含量是直接相關(guān)的。中醫(yī)臨床潛方用藥，面對(duì)品質(zhì)含量相差甚遠(yuǎn)的中藥，而臨床用量設(shè)置卻未有區(qū)別［1-3］。

波棱瓜子是葫蘆科波棱瓜屬波棱瓜(Herpetospermum caudigerum Wall.)的干燥成熟種子［4］，為藏醫(yī)常用藥，用于治療赤巴病、肝病、膽病以及消化不良［5］。波棱瓜子具有保肝降酶、抗肝炎病毒等功效［6］，在各大藏醫(yī)院廣泛應(yīng)用，在用于治療肝病的藏藥成方制劑中，有一半以上以波棱瓜子入藥。波棱瓜子藥材中主要藥效成分為木脂素類(lèi)成分［7］。前期通過(guò)對(duì)波棱瓜子的研究發(fā)現(xiàn)，波棱甲素(herpetrion，PEDX)為波棱瓜子保肝降酶的關(guān)鍵藥效組分［8］。然而臨床上，波棱瓜子用于肝病治療時(shí)用量多憑經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，為了制定其科學(xué)合理的用量范圍，本文以PEDX的量效關(guān)系為核心進(jìn)行研究［9］，通過(guò)含量比例進(jìn)行轉(zhuǎn)換，制定波棱瓜子質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)含量上下限，將此模式示范應(yīng)用于中藥抗肝纖維化質(zhì)量控制方法研究，為實(shí)現(xiàn)“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加貼近臨床，臨床用量更加科學(xué)有據(jù)”提供新思路和方法，深化中醫(yī)藥的量效關(guān)系理論［10］。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

波棱瓜子提取物(自制，PEDX含量為20.8%);PEDX對(duì)照品(自制，純度超過(guò)98%)。人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞，購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù);DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gbico公司，批號(hào):1255136);胎牛血清(美國(guó)HyClone公司，批號(hào):DPEO166);四甲基偶氮唑鹽(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，批號(hào):1324B37)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào):20120305224)均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;乙腈(色譜純，加拿大Promptar公司)，其他試劑均為分析純。

LC-20AT高效液相色譜儀 SPD-M20A檢測(cè)器(日本Shimadzu公司);BSA124S型精密電子天平(德國(guó)Sartorius公司);XDS-1B型倒置生物顯微鏡(北京京瑞天下科技有限公司);Forma Series II水套CO2培養(yǎng)箱(3110 Series II水套，Thermo Fisher公司);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO型，Thermo Scientific公司)。

1.2 PEDX系列樣品HPLC指紋圖譜的建立

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Alltima C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈 －2%冰醋酸水溶液(24∶76)，流速:1.0 ml·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm，柱溫:25℃，進(jìn)樣量:10 μl。

1.2.2 PEDX陰性樣品的制備 稱(chēng)取波棱瓜子提取物35 g用8倍量溶劑溶解，上中壓硅膠柱制備，其中溶劑由質(zhì)量比為3∶2的石油醚和丙酮組成，中壓硅膠柱由三支粒度為200～300目的120 g硅膠柱串聯(lián)組成，流動(dòng)相由石油醚∶乙酸乙酯∶丙酮按2∶7∶1的質(zhì)量比組成，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，流速為120 ml·min－1，收集不含 PEDX 的餾分，回收干燥，即得 PEDX 陰性樣品［11］。

1.2.3 PEDX對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取PEDX對(duì)照品8.0 mg，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為160μg·ml－1的PEDX對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.4 PEDX系列樣品溶液的制備 按表1將不同劑量的PEDX對(duì)照品加入到不含該成分的陰性樣品溶液(以下稱(chēng)陰性樣品溶液)中，制備不同濃度梯度的PEDX系列樣品。溶解，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液進(jìn)高效液相色譜儀。

表1 PEDX樣品的加入量

1.3 PEDX系列樣品對(duì)LX-2增殖的影響

各系列樣品先用DMSO溶解，再用培養(yǎng)基稀釋到各個(gè)不同的濃度，并使 DMSO的濃度低于1.0%［12］，不含藥物的空白溶劑作陰性對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 LX-2細(xì)胞，用 0.25%胰蛋白酶 －0.02%EDTA消化，按1×104/ml的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去上清，溫育48小時(shí)。棄去上清，按1.2.4項(xiàng)下制備方法加入PEDX系列樣品溶液，每組設(shè)6個(gè)平行孔，作用6小時(shí)，吸去上清液，每孔加入5 mg·ml－1的MTT液20μl，繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去上清液，加入DMSO 200μl，振蕩10分鐘后，在492 nm波長(zhǎng)下，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值(OD492)。根據(jù)下面的公式計(jì)算各系列樣品的抑制率。

OD1:系列樣品吸光值;OD0:空白溶劑吸光值

1.4 觀察項(xiàng)目

按1.2.1項(xiàng)下色譜條件記錄系列樣品在60分鐘內(nèi)的色譜圖，并進(jìn)行指紋圖譜分析。在進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)之前，倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，選取生長(zhǎng)、形態(tài)良好的細(xì)胞用于MTT實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，細(xì)胞抑制率數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組間的均數(shù)檢驗(yàn)采用方差分析，P＜0.05或P＜0.01時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEDX系列樣品HPLC指紋圖譜

按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件記錄60分鐘內(nèi)的色譜圖，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版進(jìn)行分析，指紋圖譜如圖1所示。相似度計(jì)算得到S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8 之間的相似度均為1.0，結(jié)果表明樣品Ⅰ～Ⅵ相似度良好，最終得到了不同濃度梯度的PEDX系列樣品。陰性樣品在PEDX保留時(shí)間處無(wú)吸收，在其余特征峰保留時(shí)間處均有吸收，說(shuō)明PEDX與陰性樣品各特征峰間無(wú)相互干擾，最終得到不含PEDX的陰性樣品。

圖1 PEDX系列樣品指紋圖譜

2.2 LX-2細(xì)胞抑制率的測(cè)定

PEDX系列樣品作用于LX-2細(xì)胞6小時(shí)后的OD492值如表2，根據(jù)抑制率計(jì)算公式得到各樣品抑制率。建立各系列樣品的量M與細(xì)胞抑制率I值的“量—效”關(guān)系曲線(xiàn)，如圖2。由PEDX組分的“量—效”關(guān)系可知，當(dāng)“量”增加到一定程度時(shí)，相應(yīng)的“效”增加的幅度減緩，甚至減弱。進(jìn)一步說(shuō)明波棱瓜子中PEDX的“量”對(duì)其“效”起著至關(guān)重要的作用，并不是“量”越大越好，也不是越小就不好。據(jù)圖2中的“量—效”關(guān)系曲線(xiàn)圖，確定波棱瓜子中藥效組分PEDX的最小有效用量為0.68 mg，這一閾值可作為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量控制的下限，最大有效用量為8.2 mg，此用量即是方藥安全有效“治療窗”的最大用量，可作為方藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量控制的上限。通過(guò)含量關(guān)系轉(zhuǎn)換，可知波棱瓜子的最小有效用量為3.27 mg，最大有效用量為39.42 mg。

表2 PEDX系列樣品對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響

圖2 PEDX系列樣品的“量—效”關(guān)系曲線(xiàn)

3 討論

本研究在前期目標(biāo)成分研究的基礎(chǔ)上，確定了PEDX為抗肝纖維化的藥效關(guān)鍵組分。通過(guò)不同劑量PEDX組分的加入，采用體外LX-2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，闡明“量—效”關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)“量—效”關(guān)系曲線(xiàn)的變化，找到加入的PEDX的最低含量點(diǎn)、最高含量點(diǎn)，再轉(zhuǎn)換為人用劑量，以此可以制定藥物的“治療窗”或推薦臨床用量范圍，為波棱瓜子抗肝纖維化作用“含量”標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了方法［13］。以此闡明中藥的組分含量與臨床用量的相關(guān)性，建立面向臨床、關(guān)乎藥效的質(zhì)量控制方法。

該研究模式的關(guān)鍵技術(shù)在于如何制備陰性樣品，為保障目標(biāo)成分及其陰性樣品的完整性，分離手段和方法是關(guān)鍵。要有高提取率、高回收率、無(wú)損、無(wú)殘留的成分快速分離技術(shù)，即一方面要多快好省地獲得目標(biāo)成分，同時(shí)對(duì)剩余陰性樣品要盡可能地保持無(wú)損和完整，目前薄層色譜技術(shù)和制備型、中壓柱層析系統(tǒng)是較好的解決手段。

該研究結(jié)果的獲得及“量”的標(biāo)準(zhǔn)的制定，為實(shí)現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)質(zhì)量控制“找得準(zhǔn)、測(cè)得準(zhǔn)、定得準(zhǔn)”目標(biāo)提供了方法和思路，也為解決目前中藥質(zhì)控格局“量而不準(zhǔn)”的癥結(jié)提供參考，有望成為中藥藥效物質(zhì)質(zhì)量控制的新模式。

進(jìn)行面向臨床的中藥質(zhì)—量一體化研究，建立質(zhì)量與用量之間換算機(jī)制，使臨床用量科學(xué)、合理、有據(jù)。以點(diǎn)代面，以藥帶方，逐步將此模式推廣應(yīng)用到其他方藥，從而實(shí)現(xiàn)中藥質(zhì)量控制從質(zhì)—量分離向質(zhì)—量一體轉(zhuǎn)變，為中醫(yī)藥臨床合理用藥特別是為實(shí)現(xiàn)中藥用量標(biāo)準(zhǔn)從無(wú)據(jù)可依到有據(jù)可依提供有力的科技支撐。

［1］鄢丹，熊吟，馬麗娜，等.建立以臨床功用為導(dǎo)向的中藥質(zhì)量評(píng)控格局與適宜模式的設(shè)想［J］.中草藥，2013，44(1):1-5.

［2］黃璐琦，唐仕歡，楊洪軍.論中藥用量的特點(diǎn)及研究的關(guān)鍵點(diǎn)［J］.中醫(yī)雜志，2009，50(3):203-205.

［3］肖小河，金城，鄢丹，等.中藥大質(zhì)量觀及實(shí)踐［J］.中草藥，2010，41(4):505-508.

［4］叢龍波，王琪，李仙義，等.藏藥波棱瓜子抗肝炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36(8):75-76.

［5］Li LY，Deji LM，Wei YF，et al.Literature data investigationin semem of Herpetospermum pedunculosum ［J］.China J Chin Mat Med，2005 Jun，30(12):893-895.

［6］韓玉梅，李正明，袁海龍，等.肝能滴丸在鴨體內(nèi)對(duì)鴨乙型肝炎病毒感染的治療效果［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(4):43-44.

［7］YUAN Hai-long，LIU Yi，ZHAO Yan-ling，et al.Herpetin，a new bioactive lignan isolated from Herpetospermum caudigerum［J］.J Chin Pharm Sci，2005，14(3):140-143.

［8］YUAN H L，YANG M，LI X Y，et al.Hepatitis B virus inhibiting constituents from Herpetospermum caudigerum ［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2006，54(11):1592-1594.

［9］肖小河，鄢丹，袁海龍，等.基于成分敲除/敲入的中藥藥效組分辨識(shí)與質(zhì)量控制模式的商建［J］.中草藥，2009，40(9):1345-1348，1488.

［10］YUAN Hai-long，ZHANG Tian-tian，XIAO Xiao-he.Knock-out＆knock-in:A novel approach for Herbal medicine research［C］.BIT's 8th Annual Congress of IDDST，2010，Beijing，China.

［11］袁海龍，郭靜靜，李仙義，等.一種制備Herperione的方法及其應(yīng)用、其膠囊劑及膠囊劑的制備方法和應(yīng)用:中國(guó)，201110072191.9 ［P］.2011-08-03.http://211.157.104.87:8080 / sipo /zljs/hyjs-yx-new. jsp? recid =CN201110072191.9＆leixin=fmzl＆title= 一種制備 Herperione的方法及其應(yīng)用、其膠囊劑及膠囊劑的制備方法和應(yīng)用＆ipc=C07D493/04(2006.01)I.

［12］趙慶兵，黃文，吳文芳，等.盾葉薯蕷難溶性甾體皂苷的提取及其抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2010，25(5):527-529.

［13］孔維軍.基于成分敲出/敲入的中藥(牛黃)藥效物質(zhì)辨識(shí)和質(zhì)量控制模式的初步研究［D］.成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2011.