普伐他汀對酒精性股骨頭壞死干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究＊

黃 可，唐毓金

（1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2010級(jí)，廣西 桂林 541004；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，廣西 百色 533000）

缺血性股骨頭壞死分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）的主要原因?yàn)榧に睾鸵掖颊T發(fā)多見。國內(nèi)外對乙醇可引起股骨頭壞死報(bào)道較多，其發(fā)生可能與過量飲酒導(dǎo)致的肝臟細(xì)胞損傷、脂質(zhì)代謝紊亂、血液高凝狀態(tài)、乙醇所致的骨細(xì)胞凋亡及微血管內(nèi)皮細(xì)胞損害有關(guān)［1－3］。本研究觀察降脂藥物普伐他汀，對家兔酒精性股骨頭壞死（alcohol－induced osteonecrosis of the femoral head，AOFH）的預(yù)防作用，以探索一種對長期飲酒人群有效預(yù)防AOFH的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 健康成年中國家兔30只，體質(zhì)量1.5～2.0kg（右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組。實(shí)驗(yàn)組12只，采用灌胃法，給予烈性白酒（乙醇含量50%）10mL·kg－1·d－1，同時(shí)給予普伐他汀2mg·kg－1·d－1口服。模型組12只，采用灌胃法，給予烈性白酒（乙醇含量50%）10mL·kg－1·d－1。對照組6只，不予任何處理。各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由取食、飲水，12周后空氣栓塞處死。

1.2 血液學(xué)檢查 血脂檢查：采用日立7600型生化分析儀分別測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高 密 度 脂 蛋 白 （high－density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low－density lipoprotein，LDL）、極低密度脂蛋白（very low－density lipoprotein，VLDL）；血液黏度檢查：采用血流變自動(dòng)檢測儀測定血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、全血高切相對指數(shù)、全血低切相對指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)、血小板黏附率。

表1 實(shí)驗(yàn)前、后各組血脂指標(biāo)檢測結(jié)果

表1 實(shí)驗(yàn)前、后各組血脂指標(biāo)檢測結(jié)果

＊：P＜0.05，與同期模型組比較；△：P＜0.05，與同期對照組比較；▲：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)前同組比較。

組別 n 時(shí)間TC TG HDL LDL VLDL實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)前 1.21±0.40 0.83±0.23 0.47±0.11 0.33±0.25 0.45±0.15模型組 12 1.34±0.34 1.10±0.32 0.62±0.22 0.27±0.16 0.44±0.08對照組 6 1.16±0.17 0.97±0.21 0.46±0.15 0.26±0.14 0.46±0.10實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)后 1.60±0.47＊ 0.92±0.62＊ 0.61±0.26＊ 0.46±0.28＊ 0.46±0.28＊模型組 12 2.58±0.66△▲ 2.52±1.43△▲ 0.39±0.14△▲ 0.94±0.47△▲ 0.75±0.25△▲對照組 6 1.20±0.34 0.84±0.34 0.45±0.08 0.27±0.17 0.47±0.20

1.3 組織病理學(xué)檢查 家兔采用空氣栓塞處死，取肝臟標(biāo)本，置于10%中性甲醛溶液中固定24h，做常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察。取股骨頭標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液固定48h，后置于Plank－Rychlo液脫鈣2周，常規(guī)石蠟包埋，制成厚4μm切片，常規(guī)HE染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察。股骨頭壞死發(fā)生率計(jì)算：根據(jù)光學(xué)顯微鏡下HE染色觀察，股骨頭壞死發(fā)生率＝各組觀察到存在壞死的動(dòng)物數(shù)／本組動(dòng)物數(shù)×100%。

1.4 透射電鏡細(xì)胞微觀察 每組取2只家兔空氣栓塞處死，在股骨頭軟骨下2～3mm處取2mm×2mm×2mm骨塊，3%戊二醛4℃環(huán)境下固定24h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）4℃環(huán)境下脫鈣8周，1%鋨酸后固定，常規(guī)包埋切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，單組樣本前、后比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，試驗(yàn)后樣本比較采用方差分析，股骨頭壞死發(fā)生率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

試驗(yàn)中因誤吸及肺部感染致實(shí)驗(yàn)組家兔死亡1只。

2.1 血脂成分分析結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組TC、TG、HDL、LDL、VLDL改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組TC、LDL較實(shí)驗(yàn)前明顯升高（P＜0.05）、HDL較實(shí)驗(yàn)前明顯降低（P＜0.05）、TG、VLDL較實(shí)驗(yàn)前升高（P＜0.05）；對照組各項(xiàng)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組 TC、TG、HDL、LDL、VLDL與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 血液流變學(xué)分析結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組全血高切還原黏度、全血高切相對指數(shù)及全血低切相對指數(shù)較實(shí)驗(yàn)前升高（P＜0.05）。模型組血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、血小板黏附率、全血低切相對指數(shù)較實(shí)驗(yàn)前升高（P＜0.05）。模型組血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度及紅細(xì)胞聚集指數(shù)與實(shí)驗(yàn)組和對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 組織病理學(xué)觀察

2.3.1 肝臟 光學(xué)顯微鏡下模型組家兔肝細(xì)胞見明顯的脂肪顆粒，在肝細(xì)胞內(nèi)聚集成氣球樣變性，部分肝細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死，周圍炎性細(xì)胞浸潤。實(shí)驗(yàn)組見肝細(xì)胞輕度水腫。對照組未見明顯的病理學(xué)改變。

2.3.2 股骨頭 肉眼見模型組家兔股骨頭表面失去光澤，未見軟骨凹陷及明顯的壞死改變，實(shí)驗(yàn)組和對照組形態(tài)無變化。光學(xué)顯微鏡下，模型組骨髓細(xì)胞可見明顯凝固性壞死，髓內(nèi)骨髓細(xì)胞減少，脂肪組織增多，脂肪細(xì)胞肥大，骨小梁鈣質(zhì)脫失、疏松，部分骨小梁崩裂，空骨陷窩增多；實(shí)驗(yàn)組鏡下病理改變較模型組輕微；對照組未見鏡下改變（圖1）。

2.3.3 骨細(xì)胞 模型組透射電鏡下觀察家兔骨細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)消失，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器溶解，細(xì)胞核膜不清、核固縮，僅留下細(xì)胞輪廓；實(shí)驗(yàn)組骨細(xì)胞微觀改變不明顯，與對照組比較基本無變化（圖2）。

2.3.4 股骨頭壞死發(fā)生率 實(shí)驗(yàn)組、模型組及對照組股骨頭壞死發(fā)生率分別為9.1%（1／11）、83.3%（10／12）和0（0／6）。模型組與實(shí)驗(yàn)組、對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 光學(xué)顯微鏡下家兔股骨頭組織（×200）

圖2 透射電鏡下3組家兔骨細(xì)胞（×15 000）

表2 3組家兔實(shí)驗(yàn)前、后血液流變學(xué)檢測結(jié)果

表2 3組家兔實(shí)驗(yàn)前、后血液流變學(xué)檢測結(jié)果

＊：P＜0.05，與同期模型組比較；△：P＜0.05，與同期對照組比較；▲：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)前同組比較。

組別 n 時(shí)間 血漿黏度（mPa.s）全血高切還原黏度（mPa.s）全血低切還原黏度（mPa.s）紅細(xì)胞聚集指數(shù)全血高切相對指數(shù)全血低切相對指數(shù)紅細(xì)胞變形指數(shù)血小板黏附率（%）實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)前 1.26±0.13 5.04±1.08 32.96±10.46 4.54±0.60 2.24±0.28 10.09±1.29 0.81±0.15 36.67±0.59模型組 12 1.25±0.12 5.53±1.18 31.09±4.83 4.00±0.29 2.92±0.58 11.65±2.38 0.80±0.09 36.13±0.29對照組 6 1.26±0.11 4.98±0.90 29.93±1.99 4.12±0.13 2.73±0.64 11.25±2.68 0.76±0.06 36.25±0.13實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)后 1.26±0.05＊ 6.07±0.59＊▲△ 41.72±3.84＊▲△ 4.66±0.24＊△ 2.67±0.26▲ 12.47±1.56＊▲ 0.87±0.04△ 36.79±0.24△模型組 12 1.43±0.13▲△ 6.84±0.41▲△ 47.58±4.04▲△ 5.07±0.36▲△ 3.00±0.40 14.82±2.34▲△ 0.86±0.05△ 37.07±0.44▲△對照組 6 1.24±0.15 5.36±0.37 29.81±1.33 3.98±0.17 2.93±0.39 11.68±1.62 0.79±0.09 36.11±0.17

3 討 論

3.1 普伐他汀可以防止乙醇引起的股骨頭壞死 酒精性股骨頭壞死的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為是由多種因素綜合作用的結(jié)果。乙醇可導(dǎo)致高脂血癥、脂肪肝和脂質(zhì)代謝紊亂，股骨頭髓內(nèi)脂肪細(xì)胞肥大，骨細(xì)胞凋亡［4－6］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組家兔TC、TG、LDL較實(shí)驗(yàn)前明顯升高、HDL較實(shí)驗(yàn)前明顯降低，VLDL較實(shí)驗(yàn)前升高。對照組并無上述改變。此結(jié)果與相關(guān)學(xué)者關(guān)于酒精性股骨頭壞死，脂代謝紊亂的結(jié)果相似［7－8］。另外，病理檢查發(fā)現(xiàn)模型組有83%（10／12）的家兔發(fā)生了不同程度的骨小梁塌陷、崩解、骨細(xì)胞死亡等，而同期實(shí)驗(yàn)組、對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明降脂藥普伐他汀對乙醇所致股骨頭壞死的發(fā)生有預(yù)防作用。

3.2 普伐他汀能抑制血小板聚集，防止骨壞死 長期飲酒可出現(xiàn)血液高凝狀態(tài)、血栓形成，導(dǎo)致骨髓腔內(nèi)血流減少，引起缺血、壞死。帥波等［9］研究發(fā)現(xiàn)，NONFH患者血小板顆粒數(shù)量及血小板表面膜糖蛋白GPⅡb／Ⅲa（PAC－1）活化率明顯增高。這些物質(zhì)在介導(dǎo)血小板活化及血栓形成的過程中起重要作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予家兔高濃度乙醇灌胃3個(gè)月后，其血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度、血小板黏附率、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯增加，與實(shí)驗(yàn)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明大量活化的血小板刺激血液高凝狀態(tài)產(chǎn)生，最終導(dǎo)致血栓形成，引起骨缺血、骨壞死［11］。實(shí)驗(yàn)組的家兔預(yù)防性口服普伐他汀片，發(fā)現(xiàn)其血小板黏附率、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度稍有升高，但與實(shí)驗(yàn)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明普伐他汀可抑制乙醇引起的血小板活化，從而抑制血小板聚集及血栓形成，防止骨壞死。

3.3 普伐他汀可防止乙醇對骨細(xì)胞的損害 乙醇對骨組織的毒性作用可直接引起股骨頭壞死［12－13］。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性股骨頭壞死的血管再生和新骨形成的能力明顯減弱。乙醇可刺激股骨頭局部血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白mRNA表達(dá)降低，引起股骨頭壞死［14］。王維軍等［15］研究認(rèn)為，大量飲酒后可見股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞減少、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性降低及分化方向改變，骨化減少，導(dǎo)致骨壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，光學(xué)顯微鏡下模型組骨小梁鈣質(zhì)明顯脫失、稀疏，部分骨小梁崩解，骨髓內(nèi)骨細(xì)胞密度顯著降低，髓內(nèi)脂肪細(xì)胞明顯增多。透射電鏡下觀察見模型組動(dòng)物骨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)消失，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器溶解，細(xì)胞核膜不清、核固縮，僅留下細(xì)胞輪廓。對照組并無上述改變。說明乙醇可刺激骨細(xì)胞凋亡，引起股骨頭壞死。同期實(shí)驗(yàn)組骨細(xì)胞并無明顯改變。說明普伐他汀能夠在一定程度上預(yù)防乙醇引起的骨細(xì)胞凋亡、壞死，防止股骨頭壞死。

綜上所述，本研究采用普伐他汀可有效預(yù)防乙醇引起的家兔高脂血癥、降低血小板活化及紅細(xì)胞聚集，防止小血管栓塞，防止乙醇引起的骨細(xì)胞凋亡，對酒精性股骨頭壞死的發(fā)生有一定的預(yù)防作用。

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