增塑淀粉生物安全性評(píng)價(jià)＊

徐小川，姚 源，田 偉，石 銳，陳大福，張秀麗

（1.北京積水潭醫(yī)院口腔科，北京 100035；2.北京市創(chuàng)傷骨科研究所，北京 100035；3.北京市第六醫(yī)院口腔科，北京 100007）

海藻酸鹽是從海洋褐藻中提純的天然多糖，應(yīng)用在制藥和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域［1－3］，缺點(diǎn)是在生理環(huán)境下容易失去物理性狀，而且對(duì)蛋白質(zhì)吸附能力不佳，從而限制了其深入應(yīng)用于上述領(lǐng)域；淀粉是陸生的天然多糖，其價(jià)格不足前者的1／10。增塑淀粉（thermoplastic starch）是北京市創(chuàng)傷骨科研究所參與研發(fā)的生物可降解材料，比普通淀粉的彈性和強(qiáng)度都有所增加。該材料具有分子量大、對(duì)小分子物質(zhì)有超強(qiáng)包容性、凝膠化能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因而可替代海藻酸鹽作為可降解材料，若加入止血?jiǎng)┗蚬切纬傻鞍椎纫蜃觿t可用作止血、誘導(dǎo)成骨等組織工程材料［4］，有望在生物醫(yī)藥、組織工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［5］。

宿主微環(huán)境中物理、化學(xué)、生物因素對(duì)生物材料的降解和轉(zhuǎn)歸有很大影響，建立能模擬宿主體內(nèi)微環(huán)境的研究平臺(tái)，從事可重復(fù)、可控的體外實(shí)驗(yàn)，將使材料的評(píng)估更加客觀［6］。但具體評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)尚無法達(dá)成共識(shí)［7］，因此，本實(shí)驗(yàn)依照醫(yī)療器 械 標(biāo) 準(zhǔn) YY／T 0127.2－93［8］、YY／T0127.1－93 及 ISO／TR7405－1984［9］、YY／T 0244－1996［10］有關(guān)規(guī)定，從急性全身毒性反應(yīng)、溶血實(shí)驗(yàn)、短期全身毒性試驗(yàn)3種方法對(duì)其生物安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)研究。

1 材料與方法

1.1 急性全身毒性反應(yīng)［8］

1.1.1 材料 增塑淀粉4g（北京化工大學(xué)提供），置入有20 mL生理鹽水的三角瓶，經(jīng)37℃浸提72h制成浸提液。小白鼠雌雄各10只，體質(zhì)量17～23g。

1.1.2 方法 小鼠雌雄隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔恒速（不超過0.1mL／s）注射浸提液50 mL／kg，對(duì)照組注射同批號(hào)滅菌生理鹽水，于注射后24、48、72 h觀察和記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物體質(zhì)量、一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)和死亡動(dòng)物數(shù)。

1.1.3 統(tǒng)計(jì)與分析 通過SPSS13.0軟件分析，考慮初始體質(zhì)量、時(shí)間、組別進(jìn)行具有一個(gè)協(xié)變量一個(gè)重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩囟抠Y料方差分析。

1.2 溶血實(shí)驗(yàn)［8］

1.2.1 材料 增塑淀粉5g，經(jīng)清洗處理后置燒瓶中加入生理鹽水10mL作為實(shí)驗(yàn)組。陰性對(duì)照為同批號(hào)0.9%氯化鈉注射液，陽性對(duì)照為蒸餾水，各準(zhǔn)備3瓶待測(cè)。

1.2.2 方法 將實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各組燒瓶置于37℃水浴中30min。然后在各瓶中加入新鮮稀釋兔血0.2 mL輕輕搖勻，在同溫水浴中維持60min，取上清液于545nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。溶血率計(jì)算公式：溶血率（%）＝［（實(shí)驗(yàn)樣品的吸光度－陰性對(duì)照的吸光度）／（陽性對(duì)照的吸光度－陰性對(duì)照的吸光度）］×100%。

1.3 短期全身毒性試驗(yàn) 經(jīng)口途徑［8］。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只SD大白鼠，體質(zhì)量420～480g，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6只，雌雄各半，并標(biāo)記大鼠。

1.3.2 灌胃劑制備 將增塑淀粉制成濃度20%的混懸液，4℃環(huán)境保存待用。

1.3.3 灌胃 用連有灌胃針的注射器灌胃，給服劑量為每日1g／kg體質(zhì)量，對(duì)照組給服同體積的浸提介質(zhì)（0.9%生理鹽水）。記錄大鼠體質(zhì)量并依此調(diào)節(jié)灌胃劑量，時(shí)間7d。停止灌胃后再連續(xù)測(cè)量體質(zhì)量5d。

1.3.4 結(jié)果判斷及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 觀察大鼠的體質(zhì)量變化、運(yùn)動(dòng)和呼吸狀態(tài)以及死亡情況。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、考慮連續(xù)灌胃第7天體質(zhì)量、時(shí)間、組別進(jìn)行具有一個(gè)協(xié)變量、一個(gè)重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩囟抠Y料方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 急性全身毒性反應(yīng)結(jié)果 在24、48、72h觀察期內(nèi)，兩組動(dòng)物狀況良好，進(jìn)食及運(yùn)動(dòng)如常，行動(dòng)敏捷，無痙攣、運(yùn)動(dòng)障礙和死亡等毒性反應(yīng)，體質(zhì)量逐日增加。對(duì)兩組初始體質(zhì)量（20.80±1.40，19.60±1.58）采用t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1.80，P＝0.09），說明兩組之間初始體質(zhì)量具有可比性（表1）。兩組之間在24、48、72h體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

初始體質(zhì)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義重大（F＝15.21，P＝0.000 3）（見表2），同一組各時(shí)間點(diǎn)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝10.19，P＝0.000 2），組別與各時(shí)間點(diǎn)之間比較無交互作用（F＝0.11，P＝0.894 3）?？紤]初始體質(zhì)量影響后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間24、48、72h體質(zhì)量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.175 8，0.175 8，0.375 6），見表3。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)描述性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果體質(zhì)量（g

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)描述性統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果體質(zhì)量（g

組別 初始24h 48h 72h實(shí)驗(yàn)組 20.80±1.40 21.80±1.48 22.80±1.40 24.20±1.75對(duì)照組 19.60±1.58 22.20±1.48 23.20±2.15 24.20±2.39

表2 考慮初始體質(zhì)量、時(shí)間、組別進(jìn)行具有一個(gè)協(xié)變量一個(gè)重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩囟抠Y料方差分析結(jié)果

表3 考慮初始體質(zhì)量影響后兩組各時(shí)間體質(zhì)量變化比較

2.2 溶血試驗(yàn)結(jié)果 見表4。經(jīng)計(jì)算增塑淀粉溶血率＝2.06%。

2.3 短期全身毒性試驗(yàn)（經(jīng)口途徑）結(jié)果 見表5。對(duì)灌胃后體質(zhì)量變化分析如下（表6）：初始體質(zhì)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義重大（F＝219.30，P＜0.000 1），將組別因素和時(shí)間因素共同考慮時(shí)兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.42，P＝0.246 5），但各組間及各時(shí)間點(diǎn)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.42，P＝0.044 9；F＝5.88，P＝0.000 8）。停止灌胃后兩組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量變化見表7。

表4 增塑淀粉溶血吸光度值

表5 灌藥7d中兩組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

表5 灌藥7d中兩組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

時(shí)間 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組t P第1天436.33±34.72 443.67±31.23 －0.384 7 0.708 6第2天 425.33±37.43 442.33±28.66 －0.883 3 0.399 2第3天 423.00±32.81 441.67±30.81 －1.015 9 0.333 7第4天 417.00±36.22 442.33±31.07 －1.300 4 0.223 3第5天 416.33±34.30 438.67±33.03 －1.148 9 0.277 4第6天 409.00±34.77 433.33±30.16 －1.294 8 0.225 0第7天411.67±34.86 429.67±32.51 －0.925 1 0.376 8

表6 連續(xù)灌胃第7天體質(zhì)量、時(shí)間、組別進(jìn)行具有一個(gè)協(xié)變量一個(gè)重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩囟抠Y料方差分析

表7 停止灌胃后兩組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量變化（g

表7 停止灌胃后兩組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量變化（g

指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組t P第1天412.60±32.83 424.67±36.54 1.36 0.196 3第2天 415.60±33.86 423.00±35.30 2.30 0.038 6第3天 417.00±35.16 423.33±36.98 2.50 0.026 5第4天 419.00±36.55 424.33±36.43 2.70 0.018 1第5天420.67±35.72 431.00±40.77 1.70 0.113 5

3 討 論

對(duì)于接觸人體或在體內(nèi)使用的生物材料，其化學(xué)性能將會(huì)直接影響人體的安全性。因此，對(duì)材料中的殘留單體、有害金屬元素、各種添加劑應(yīng)嚴(yán)格控制。只有通過生物學(xué)評(píng)價(jià)來進(jìn)一步確認(rèn)這些用品是否安全，以便決定是否可以最終在臨床使用。一是動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，即將材料植入體內(nèi)，分階段將植入體與周圍組織取出，做組織學(xué)觀察；另一類為體外試驗(yàn)，即用材料或材料浸提液觀察材料對(duì)組織細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及增殖方面的影響［9］。1997年國家醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886等采用ISO10993－1992標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)了中國生物醫(yī)用材料研究的發(fā)展和水平的提高［10］。生物學(xué)評(píng)價(jià)流程為首先進(jìn)行體外生物學(xué)評(píng)價(jià)（如溶血試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)），根據(jù)結(jié)果對(duì)產(chǎn)品提出改性建議，合格后再進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物學(xué)評(píng)價(jià)（如急性全身毒性、短期全身毒性）和動(dòng)物實(shí)體模擬試驗(yàn)，再根據(jù)體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)產(chǎn)品提出進(jìn)一步改進(jìn)的建議，最后進(jìn)行臨床研究。

血液相容性指標(biāo)是針對(duì)植入物材料生物安全性的關(guān)鍵參數(shù)，但由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性及不確定性，目前尚無完善的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)遵照國家YY／T0127.1－93的要求，采用直接接觸方法，測(cè)得材料的溶血率為2.06%（表4），指標(biāo)在正常上限的50%以下，提示該材料優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn)［8］。

在急性全身毒性和經(jīng)口短期全身毒性中，除了動(dòng)物體質(zhì)量和死亡是可以明確判斷的指標(biāo)外其余均屬于描述性語言，因而在動(dòng)物零死亡且惟一的定量指標(biāo)是“體質(zhì)量”的情況下，引入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以使結(jié)果更加有理可依。

急性全身毒性試驗(yàn)中選用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方式除了考慮初始體質(zhì)量外，如急性全身毒性試驗(yàn)初始體質(zhì)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義重大（表2，F(xiàn)＝15.21，P＝0.000 3），還加入了組別及時(shí)間因素綜合考慮，如同一實(shí)驗(yàn)中組別與各時(shí)間點(diǎn)之間比較無交互作用（表2，F(xiàn)＝0.11，P＝0.894 3），在此基礎(chǔ)上顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間24、48、72h體質(zhì)量變化比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3，P＝0.175 8，0.175 8，0.375 6），避免了大量信息因統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選擇不當(dāng)而丟失，所得結(jié)果可信度大大提高。

短期全身毒性——經(jīng)口途徑是醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)接觸骨組織、血液組織所必須的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)［11］。采用 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)并考慮連續(xù)灌胃7d體質(zhì)量、時(shí)間、組別進(jìn)行具有一個(gè)協(xié)變量一個(gè)重復(fù)測(cè)量?jī)梢蛩囟抠Y料方差分析?？紤]組別和時(shí)間因素（表6，F(xiàn)＝1.42，P＞0.05）提示增塑淀粉對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未造成傷害。

停止灌胃2～4d兩組動(dòng)物體質(zhì)量有差異，可能的原因是對(duì)照組中一只動(dòng)物灌胃致食道損傷引發(fā)體質(zhì)量變化而產(chǎn)生偏倚，但在第5天體質(zhì)量已無差別（t＝1.70，P＝0.113 5），提示灌胃產(chǎn)生的損傷2～3d才能恢復(fù)。

增塑淀粉作為替代海藻酸鹽的可降解組織工程材料，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示了較好的安全性能，有研究將其與聚乙烯醇聯(lián)合制備為引導(dǎo)組織再生膜［5］明顯優(yōu)于聚乳酸和聚乳酸－羥基乙酸共聚物膜，進(jìn)一步的材料學(xué)改善將使增塑淀粉盡快進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

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