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    T細胞斑點試驗在結(jié)核病中的診斷價值

    2013-08-22 12:37:42劉艷
    當代醫(yī)學 2013年8期
    關(guān)鍵詞:點數(shù)結(jié)核結(jié)核病

    劉艷

    結(jié)核是我國的重大傳染病之一,也是威脅全球健康的呼吸道傳染病。近年來,結(jié)核病有明顯上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計,全球目前有約20億的人感染過結(jié)核分枝桿菌[1]。如何快速準確的診斷活動性結(jié)核患者對結(jié)核病的防控尤為重要。傳統(tǒng)的抗酸桿菌涂片敏感性僅有50%~60%。分枝桿菌培養(yǎng)是目前臨床上應(yīng)用于結(jié)核病診斷的金標準,但其需等6~8周時間才能有結(jié)果,培養(yǎng)要求較高,培養(yǎng)陽性率偏低。目前對菌陰肺結(jié)核、兒童結(jié)核及肺外結(jié)核的診斷仍比較困難。本研究通過對49例確診結(jié)核患者及47例非結(jié)核患者行T-SPOT.TB檢查,探討其在結(jié)核病的臨床診斷價值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料2011年3月~2012年8月我科收治菌陰結(jié)核及肺外結(jié)核(肺結(jié)核符合中華結(jié)核病診治指南診斷標準,淋巴結(jié)結(jié)核為病理證實,結(jié)核性胸膜炎、腰椎結(jié)核、結(jié)核球為治療隨訪后證實)患者49例(觀察組),平均年齡(47±19)歲,其中男27例,女22例。49例結(jié)核患者中,肺結(jié)核患者42例,結(jié)核性胸膜炎3例,腰椎結(jié)核1例,淋巴結(jié)結(jié)核2例,結(jié)核球1例。對照組47例,為經(jīng)相關(guān)檢查及治療后排除結(jié)核感染的患者,其中男28例,女19例,平均年齡(53±19)歲。47例患者中,其中肺炎34例,陳舊性結(jié)核2例,胸腔積液2例,腹腔積液1例,慢性支氣管炎1例,發(fā)熱1例,惡性腫瘤3例,慢性咳嗽1例,腮腺腫大1例,間質(zhì)性肺炎1例。兩組資料年齡、性別均無統(tǒng)計學差異。

    1.2 試劑與方法 T-SPOT.TB:T-SPOT.TB試劑盒(上海復(fù)星科技有限公司提供)。肝素抗凝管采集8 mL外周靜脈血,離心分離外周血單核細胞(PBMC)。于顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù),配置每100微升含有25萬細胞的標準溶液。取出T-SPOT.TB試劑盒內(nèi)微板孔,陰性對照加入細胞培養(yǎng)液,陽性對照加入植物血凝素,另外兩孔分別加入抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)各50 μL,然后每孔加入100 μL含有PCMC的上述細胞懸液,置于CO2培養(yǎng)箱37℃溫度孵育16~20 h,用pH值6.8~7.2的PBS液洗脫,加入堿性磷酸酶標記的抗IFN-γ單克隆抗體50 μL,4℃孵育2 h,再用PBS液洗脫,每空加入顯色液50 μL。避光室溫靜置7 min,蒸餾水沖洗后觀察結(jié)果,用放大鏡人工計數(shù)每空斑點數(shù)。陽性結(jié)果定義為:當陰性對照孔點數(shù)為0~5時,測量孔點數(shù)減去對照孔點數(shù)≥6,當陰性對照孔點數(shù)≥6時,測量孔點數(shù)≥兩倍對照孔點數(shù)[2]。

    結(jié)核菌素試驗(PPD):PPD(結(jié)核菌素純蛋白衍生物,四川成都生物技術(shù)公司生產(chǎn),50 U/mL),以5 U注入左前臂內(nèi)側(cè)上中1/3交界處皮內(nèi),使之形成皮丘,48~72 h觀察反應(yīng),結(jié)果判斷以局部硬結(jié)直徑為依據(jù),<5 mm為陰性,5~9 mm為一般陽性反應(yīng),10~19 mm為中度陽性反應(yīng),≥20 mm或不足20 mm但有水皰或壞死為強陽性反應(yīng)[3]。

    結(jié)核抗體:采用膠體金標法,按試劑說明書操作。結(jié)核抗體檢測試劑由MP生物醫(yī)學亞太私人有限公司提供。

    1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    觀察組中47例T-SPOT.TB檢測陽性,敏感性為95.9%,與PPD及結(jié)核抗體比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。對照組中,2例T-SPOT.TB陽性,特異性為95.7%,與PPD及結(jié)核抗體比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

    表1 T-SPOT.TB試劑與PPD、結(jié)核抗體結(jié)果比較[n(%)]

    3 討論

    近年來,結(jié)核病的發(fā)生率呈明顯上升趨勢。據(jù)估計2010年,全球新增結(jié)核病例共880萬例,約145萬患者死于結(jié)核感染[4]。我國是世界上僅次于印度的第二個結(jié)核病高負擔國家,結(jié)核感染率為44.5%,活動性結(jié)核患者450萬,每年死亡人數(shù)達13萬[5]。我國是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一,2000年中國第四次全國結(jié)核病流行病學調(diào)查資料[5]顯示,活動性肺結(jié)核患病率為367/10萬,菌陽肺結(jié)核患病率為160/10萬,涂陽肺結(jié)核患病率為122/10萬。而這一數(shù)據(jù)現(xiàn)仍呈上升趨勢。

    結(jié)核菌的病原學檢查是診斷結(jié)核的金標準,但其受標本中細菌的數(shù)量影響大,常規(guī)培養(yǎng)需要時間長,且培養(yǎng)陽性率偏低,不利于肺結(jié)核的早期發(fā)現(xiàn)、診斷與治療。PPD試驗是目前篩查結(jié)核感染的主要防范,但其某些抗原成分與卡介苗及非結(jié)核性分枝桿菌抗原成分相同,易發(fā)生交叉反應(yīng),從而導致假陽性的發(fā)生,且對于老年患者、免疫抑制、重癥、HIV感染及移植患者,存在假陰性[6-7]。此外,皮試操作和結(jié)果存在主觀性,從而進一步降低其檢查的準確性。因此尋找快速、高效診斷活動性結(jié)核病的診斷方法尤為重要。T-SPOT.TB檢查是以特異性抗原為刺激源,應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)診斷結(jié)核病的新方法,其具有較高的敏感性和特異性,且耗費時間較短,僅1 d。

    Ma-hariras等[8]在1996年發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中存在一段名為“RD 1”的基因序列。1999年,Behr等[9]應(yīng)用基因芯片技術(shù)將結(jié)核分枝桿菌標準株H 37 Rv和BCG的全基因組進行比較,發(fā)現(xiàn)129個只存在于結(jié)核分枝桿菌而BCG缺失的開放讀碼框,其被劃分為16個區(qū)域,后分別被命名為RD 1~RD 16,其中RD 1被證實為結(jié)核分枝桿菌所特有,在卡介苗菌株中均不存在。RD 1編碼產(chǎn)生兩種蛋白:CFP-10和ESAT-6,為結(jié)核分支桿菌特異性蛋白。結(jié)核感染人體后,體內(nèi)產(chǎn)生特異性的記憶性T淋巴細胞,當抗原再度刺激時,其能產(chǎn)生特異性的細胞因子IFN-γ。Lalvani等[10]以CFP-10和ESAT-6混合抗原多肽為刺激源刺激這些記憶性T淋巴細胞,使其分泌IFN-γ,檢測其細胞數(shù),從而發(fā)現(xiàn)診斷結(jié)核感染的T-SPOT.TB這一新方法。

    目前大量研究證實T-SPOT.TB檢測對于結(jié)核感染具有較高的敏感性和特異性。Pai等[11]的meta分析提示T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的敏感性為90%。Dai等[12]最新的meta分析提示T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的敏感性和特異性分別為88%和89%。而在免疫抑制患者中,T-SPOT.TB同樣顯示出較高的敏感性和特異性。Chapman等[13]的研究顯示,39例HIV陽性的結(jié)核患者中T-SPOT.TB的敏感性為90%,而PPD皮試僅為72%。Kim等[14]研究顯示,72例肺外結(jié)核患者的T-SPOT.TB和PPD的敏感性分別為94%和47%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。Liao等[15]的研究結(jié)果同樣顯示,T-SPOT.TB在肺外結(jié)核患者中有較高的敏感性和特異性,診斷的敏感性達到95%以上。國內(nèi)霍菲菲等[16]的資料顯示T-SPOT.TB在31例細菌學或組織學確診的肺外結(jié)核患者中的敏感性為93.5%。我們的結(jié)果與國內(nèi)外的報道相一致,T-SPOT.TB在診斷結(jié)核的敏感性和特異性分別為95.9%和95.7%,與PPD、結(jié)核抗體相比起具有更高的敏感性和特異性。

    結(jié)核病很多沒有特異性的臨床表現(xiàn),且PPD、結(jié)核抗體檢測、抗酸桿菌涂片菌均因其敏感性和特異性不夠,因此臨床常對結(jié)核病出現(xiàn)漏診、誤診。結(jié)核菌陽性率不高且培養(yǎng)時間較長,一般均在患者出院后才能出具報告,限制了其在臨床上的應(yīng)用。而T-SPOT.TB在診斷結(jié)核病方面有著較高的特異性和敏感性,且時間短,24 h內(nèi)即可出具結(jié)果,因此在輔助結(jié)核病的診斷方面有著較高的應(yīng)用價值,值得在臨床上推廣應(yīng)用,為患者早期診斷、早期治療提供幫助。

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    [3]陳灝珠,林果為.實用內(nèi)科學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:600.

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    [16]霍霏霏,張麗帆,劉曉清.評價γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB在肺外結(jié)核病診斷中的敏感性[J].中國醫(yī)學科學院學報,2009,31(4):449-452.

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