微小巴貝蟲在不同免疫狀態(tài)小鼠體內(nèi)消長規(guī)律研究

蔡玉春，盧 艷，陳韶紅，郭 儉，陳木新，田利光，張玲玲，周 洋，陳家旭

2010年河南、安徽等地發(fā)生因蜱蟲叮咬引發(fā)人相關(guān)疾病流行的報道引人關(guān)注。蜱可傳播多種疾病，已經(jīng)確認經(jīng)蜱叮咬感染人的巴貝蟲只有4種，即：微小巴貝蟲（Babesiamicroti）也稱田鼠巴貝蟲；牛巴貝蟲（B.bovis），歧異巴貝蟲（B.divegen）；和馬巴貝蟲（B.equi），至少還有3種未定種的巴貝蟲也可以感染人體。其中以微小巴貝蟲感染為多見［1－8］。本文以引進的微小巴貝蟲建立動物模型，觀察其在不同免疫狀態(tài)動物體內(nèi)的動態(tài)規(guī)律，為巴貝蟲病致病機制、診治技術(shù)及防控措施等研究奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 蟲株 微小巴貝蟲（Babesiamicroti），peabody mjr株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC），貨號：PRA－99

1.1.2 實驗動物 BALB/c小鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（severe combined immune deficiency，SCID）、非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID）均購自中科院上海實驗動物中心。

1.2 儀器和試劑 顯微鏡（日本奧林巴斯公司），EDTA抗凝采血管（浙江拱東醫(yī)療科技有限公司），0.9%生理鹽水（上海長富制藥公司），地塞米松（山東新華制藥公司），吉姆薩染液原液（上海怡成生物科技公司），甲醇（上海振興化工一廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 BALB/c小鼠免疫抑制 3周齡雌性BALB/C小鼠腹腔注射地塞米松，0.5 mg/只，連續(xù)注射5 d。

1.3.2 動物接種 感染種鼠（紅細胞染蟲率，即蟲密度為60%）眶竇取血，置EDTA抗凝采血管中，在無菌條件下以1∶3比例加0.9%生理鹽水，使蟲密度約為20%，腹腔接種正常BALB/c小鼠、免疫抑制BALB/c小鼠、SCID小鼠以及NOD－SCID小鼠，100μL/只，每組5只，4只接種鼠，1只為正常鼠。

1.3.3 薄血片吉姆薩染色 從接種當天及接種后每天尾部采血涂制薄血片，吉姆薩染色鏡檢觀察紅細胞染蟲率。

1.3.4 紅細胞染蟲率計算 油鏡下觀察染色血片，統(tǒng)計視野中每500個紅細胞的染蟲紅細胞數(shù)量，計算染蟲紅細胞占此500個紅細胞的百分率即為當天的巴貝蟲染蟲率。

2 結(jié) 果

2.1 不同小鼠體內(nèi)B.microti動態(tài)變化情況BALB/c小鼠組感染后第3 d在紅細胞內(nèi)查見蟲體，之后紅細胞染蟲率升高，第4 d起紅細胞染蟲率即達20%，第7 d達到高峰（染蟲率82.4%），隨后蟲密度開始降低，染蟲率在20%以上約持續(xù)7天，至第20 d，染蟲率降為2.45%，隨后一直保持在0%－2%的較低水平狀態(tài)。免疫抑制BALB/c小鼠感染后第2 d查見蟲體，第3 d染蟲率達到20%以上，第5 d染蟲率最高，后緩慢降低，第12 d又出現(xiàn)染蟲率高峰為50.88%，至第16 d仍維持在20%以上，染蟲率在20%以上約持續(xù)14 d，第24 d后下降至2%以下，以后維持在0%～2%的較低水平。NODSCID小鼠感染后第3 d在紅細胞內(nèi)查見蟲體，第4 d蟲密度升高，第5 d時達20%，第7 d達高峰（染蟲率72.5%），隨后逐漸下降，第12 d降至低谷（染蟲率20.8%），隨后蟲密度再次升高，分別于第16 d、第24 d出現(xiàn)2次染蟲率升高又下降的過程，至觀察結(jié)束，平均染蟲率為41.9%。SCID小鼠于感染后第3 d紅細胞內(nèi)查見蟲體，第5 d開始上升，第8 d達高峰（染蟲率86.4%），隨后蟲密度逐漸下降，第12 d降至低谷，隨后蟲密度再次升高，至第18 d出現(xiàn)第二次染蟲率最高為62.2%，之后緩慢降低，至觀察的第30 d，染蟲率仍為31.4%，平均染蟲率為38.2%（圖1，表1）。

2.2 血涂片中巴貝蟲形態(tài) 在4種不同小鼠體內(nèi)，微小巴貝蟲蟲體寄生在紅細胞內(nèi)，多數(shù)為兩蟲寄生，有的多達6蟲寄生。蟲體很小，核呈紫色，漿呈蘭色，形態(tài)多種多樣，從點狀體、小的環(huán)狀形到大的阿米巴樣形不一，可呈淚滴狀、戒子狀、圓形、梨形、棒狀或歧異形。但以環(huán)狀體為主，還可見 四聯(lián)型”或“馬耳他十字型”。圖2中為在BALB/c小鼠薄血片中發(fā)現(xiàn)的比較典型的巴貝蟲形態(tài)：有小點狀體，馬耳他十字，小環(huán)狀體，環(huán)狀體，長絲狀體，以及感染高峰時段游離在紅細胞外大量蟲體。

表1 不同小鼠體內(nèi)B.microti動態(tài)變化Tab.1 Infection dynamics of Babesia microti in different groups

圖1 不同組小鼠染蟲率和時間的關(guān)系曲線圖A：BALB/c小鼠組；B：免疫抑制 BALB/c小鼠組；C：NOD－SCID小鼠組；D：SCID小鼠組.Fig.1 Infection dynamics curve of Babesia microti in different groupsA：BALB/c mice；B：BALB/c mice of immune suppression；C：NOD－SCID mice；D：SCID mice

2.3 巴貝蟲在不同組小鼠體內(nèi)形態(tài)變化情況 選取感染巴貝蟲的BALB/c小鼠、免疫抑制BALB/c小鼠、NOD－SCID小鼠、SCID小鼠第3 d、第7 d、第11 d、第15 d、第19 d和第23 d的血涂片來觀察巴貝蟲在不同小鼠體內(nèi)變化情況。巴貝蟲在BALB/c小鼠和免疫抑制BALB/c小鼠變化情況較為一致，在第四天出現(xiàn)少量環(huán)狀體，第7d紅細胞內(nèi)出現(xiàn)大量蟲體，紅細胞裂解，蟲體形態(tài)各異，小環(huán)狀體，大環(huán)狀體，長絲狀體等，有些為兩蟲、三蟲寄生，第11 d、第15 d仍有較多紅細胞被蟲體寄生，多為點狀體和小環(huán)狀體，至第19 d、第23 d染蟲紅細胞明顯大量減少，每視野中僅見2～4個環(huán)狀體。NOD－SCID小鼠組，第4 d也出現(xiàn)少量蟲體，多為單蟲寄生，環(huán)狀體，第7 d、第11 d大量紅細胞被蟲體感染，且出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，多為幼織紅細胞感染，多環(huán)狀體，少量蟲體游離在外；第15 d已有大量蟲體游離在外，紅細胞大量裂解，染蟲紅細胞多為2～4蟲感染，多大環(huán)狀體和長絲狀體；第19 d仍溶血嚴重，視野中僅可見少量紅細胞，多為新補充的幼織紅細胞，蟲體多為長絲狀體；第23 d紅細胞有所恢復(fù)，但仍舊可見較多點狀體、環(huán)狀體和長絲狀體等蟲體。SCID小鼠組同NOD－SCID小鼠組較為一致，每視野中染蟲紅細胞都較多，有溶血現(xiàn)象，至第23 d染蟲紅細胞數(shù)量無明顯下降（圖3）。

3 討 論

巴貝蟲是一類機會性致病寄生蟲，一些巴貝蟲也是人獸共患寄生蟲，如微小巴貝蟲、歧異巴貝蟲等，即可感染動物，也可機會性感染人。近年來，巴貝蟲在人體感染的病例時有報道，且呈世界性分布。不同人對巴貝蟲感染癥狀反應(yīng)不一。癥狀輕者體溫正常，略有不適；重者驟然發(fā)病，高熱，惡寒戰(zhàn)栗，頭痛劇烈，惡心嘔吐；危重患者甚至迅速發(fā)展為溶血性貧血，伴發(fā)黃疸、蛋白尿、血尿及腎功能障礙等，脾臟切除患者、老年以及細胞免疫功能低下患者，感染癥狀較正常人嚴重［9］。脊椎動物和蜱是巴貝蟲的兩個宿主，當感染性蜱叮咬宿主吸血時，子孢子隨唾液進入宿主體內(nèi)，侵入紅細胞進行裂體增殖；部分裂殖子形成雄、雌配子體，配子體在蜱叮咬宿主時進入蜱體內(nèi)，進行配子生殖和包子增殖，在蜱唾液腺發(fā)育成孢子體，并通過蜱叮咬宿主時感染哺乳動物宿主，進入下一個循環(huán)［10］。隨著戶外活動的增加，人們暴露于蜱蟲叮咬的機會也增加，特別對于脾臟切除等免疫功能低下的患者，更易感染；另外，無癥狀的帶蟲者也可通過輸血傳播［11］。

本研究觀察了微小巴貝蟲感染不同免疫狀態(tài)BALB/c小鼠、SCID小鼠和 NOD－SCID小鼠后，紅細胞內(nèi)的動態(tài)變化情況。由動態(tài)曲線圖可以看到，微小巴貝蟲感染正常BALB/c小鼠和免疫抑制的BALB/c小鼠，在免疫抑制的BALB/c小鼠體內(nèi)，感染后2 d就出現(xiàn)較多蟲體，出現(xiàn)兩次感染高峰，且感染時間較正常BALB/c小鼠長。在感染高峰時段，出現(xiàn)較多多蟲感染現(xiàn)象，但在觀察的30 d中，最終感染率會降至較低水平，第25 d后下降至2%以下，以后維持在0%～2%的較低水平。而SCID小鼠組和NOD－SCID小鼠組與這兩組BALB/c小鼠有很大不同，微小巴貝蟲在其體內(nèi)有感染率的上下波動，但一直處于較高水平，平均感染率NOD－SCID小鼠為41.9%，SCID小鼠組為38.2%。這一現(xiàn)象給我們很大的啟示，由于SCID小鼠是嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，而NOD/SCID小鼠是SCID小鼠與非肥胖性糖尿病小鼠（NOD/Lt）品系回交的免疫缺陷鼠，不僅擁有C.B－17 SCID鼠的特征，缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，不再發(fā)生自身免疫性糖尿病，同時還表現(xiàn)出NOD小鼠所具有的多種固有免疫缺陷，包括NK細胞活性低、骨髓功能發(fā)育不正常（巨噬細胞對LPS反應(yīng)性分泌IL－1的能力下降）、約30%純合子無補體成分c5并缺乏補體系統(tǒng)的溶血活性［12－13］。所以，微小巴貝蟲蟲體在NOD/SCID小鼠和SCID小鼠體內(nèi)存活時間長，不被免疫系統(tǒng)清除，這提示NOD/SCID小鼠和SCID小鼠可能是保存微小巴貝蟲良好的動物模型，也是一個研究免疫反應(yīng)機理的很好的模型。

圖2 BALB/c小鼠體內(nèi)不同巴貝蟲形態(tài)A：點狀體；B：馬耳他十字；C：小環(huán)狀體；D：環(huán)狀體；E：長絲狀體；F：細胞外蟲體Fig.2 Blood smear of BALB/c mice infected with Babesia microtiA：Small point－like body；B：Maltese cross；C：A small circular ring；D：Circular ring；E：Long threadlike body；F：Parasites free outside of red blood cells.

圖3 不同組小鼠感染巴貝蟲血涂片A：BALB/c小鼠組；B：免疫抑制BALB/c小鼠組；C：SCID小鼠組；D：NOD－SCID小鼠組Fig.3 Blood smear of different mice groups infected with Babesia microtiA：BALB/c mice；B：BALB/c mice of immune suppression；C：SCID mice；D：NOD－SCID mice

另外，由巴貝蟲感染不同小鼠血涂片可以看到，大量蟲體侵染紅細胞，蟲體的生長、裂殖導致紅細胞大量溶血，引起小鼠溶血性貧血，且尿成黃色。在未處理和免疫抑制BALB/c小鼠體內(nèi)，雖染蟲率高峰時段也可達到82.4%和73.2%，且出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，但7～10 d后，由于免疫系統(tǒng)的作用，蟲體最終會下降至0%～2%的較低水平，且以后染蟲率不會再升高。而缺乏免疫系統(tǒng)的NOD/SCID小鼠組，蟲體可在其體內(nèi)反復(fù)增值，裂解紅細胞。這說明小鼠的免疫系統(tǒng)起到關(guān)鍵的作用，免疫系統(tǒng)健全的個體，就可以通過自身免疫系統(tǒng)的清除作用，將蟲體大量清除以使其處于很低的水平，但卻成為一個隱性帶蟲者，這在輸血時會造成很大的危害，在美國等國家已經(jīng)受到重視［14－15］；而免疫系統(tǒng)低下或切脾等免疫系統(tǒng)不健全者，則像SCID小鼠和NOD/SCID小鼠一樣存在很大的風險［16］。

本次研究獲得了微小巴貝蟲在BALB/c小鼠、SCID小鼠和NOD/SCID小鼠體內(nèi)動態(tài)變化的規(guī)律；通過免疫抑制BALB/c小鼠充分說明了免疫系統(tǒng)對小鼠體內(nèi)清除微小巴貝蟲的重要作用；且初步建立了巴貝蟲感染SCID小鼠、NOD/SCID小鼠的免疫缺陷模型，為進一步開展巴貝蟲感染宿主免疫因子及免疫細胞在清除微小巴貝蟲時的作用打下了堅實的理論和實驗基礎(chǔ)。

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