p TWIN1－EgAgB8/3自剪切融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

張瑞妮，吾拉木·馬木提，于春洋，法蒂瑪·木特力甫

細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcusgranulosus）感染狗等犬科動物是人體囊型包蟲病的主要傳染源，因此犬感染細(xì)粒棘球絳蟲情況的動態(tài)監(jiān)測、合理驅(qū)蟲治療是預(yù)防和防制包蟲病流行的關(guān)鍵性措施之一，而篩選具有較高特異性的有效抗原成分是運用糞抗原檢測方法快速診斷棘球絳蟲感染犬的重要前提。抗原B（AgB）是包蟲囊液中主要的分泌性抗原成分，由一組大小約8 k D左右的同源性較高的亞單位（抗原B 8k D亞單位）聚合形成的分子量為120～160 k Da的耐熱性多聚蛋白，并被認(rèn)為是目前用于包蟲病免疫學(xué)診斷中具有較高敏感性和特異性的抗原之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)抗原B 8 k D亞單位由AgB8/1、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4、AgB8/5等5個基因表達(dá)［1－3］。Mamuti等［4－6］研 究 發(fā) 現(xiàn) 細(xì) 粒 棘 球 絳 蟲 的AgB8/3（Eg AgB8/3）在棘球絳蟲成蟲階段出現(xiàn)大量表達(dá)現(xiàn)象。且Eg AgB8/3是蟲體分泌性蛋白，可隨感染犬的糞便排出體外，易于被檢測，有望成為ELISA夾心法診斷棘球絳蟲感染犬糞抗原檢測的候選靶蛋白。為此，陳潔等［7］利用 Trx－Eg AgB8/3重組蛋白制備多克隆抗體具有較高的敏感性和特異性，但還是與9%的犬復(fù)孔絳蟲自然感染犬糞出現(xiàn)了交叉反應(yīng)，這很可能歸因于融合表達(dá)的TRx造成的非特異性交叉反應(yīng)，為克服交叉反應(yīng)，本研究應(yīng)用融合標(biāo)簽自剪功能的表達(dá)載體p TWIN1對Eg AgB8/3進行了表達(dá)純化并鑒定其生物學(xué)活性。通過幾丁質(zhì)柱將融合蛋白的純化和融合標(biāo)簽自剪切一步完成并可自動釋放目的蛋白r Eg AgB8/3多肽，無需借助外源蛋白酶，從而節(jié)省了時間和成本，并為后續(xù)具有較高特異性抗體的制備和運用糞抗原檢測方法診斷棘球絳蟲感染犬奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 與 質(zhì) 粒 p ET32a－Eg AgB8/3－E.coliBL21（DE3）LysS原核表達(dá)系統(tǒng)為新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室保存，克隆質(zhì)粒p EASY－T1和原核表達(dá)純化載體系統(tǒng)IMPACTTM－TWIN分別購自Transgene和NBA公司，大腸桿菌E.coliDH5α和E.coliB ER2566分別購自Transgene和NBA公司。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒（Bioteke公司），PCR試劑盒（Takara公司），質(zhì)粒小量抽提試劑盒（OMEGA公司），抗CBD抗血清、無填料層析柱、彩色預(yù)染蛋白Ladder、DTT（北京NBA公司），PVDF膜，WesternBreeze試劑盒（Invitrogen公司）。

1.1.3 主要儀器 MyCycler PCR儀（Bio－Rad公司），電泳儀、凝膠成像儀（Bio－Rad公司），HC－3018高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份公司）。

1.1.4 引物設(shè)計與合成 細(xì)粒棘球蚴Eg AgB8/3基因序列（GenBank登錄號為AF362442），利用DNAman軟件設(shè)計引物，在上游引物P1的5′端添加GGT保護性堿基和限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點，下游引物P2的5′端加GGT保護性堿基和限制性內(nèi)切酶BamH I酶切位點，P1：5′－GGTGAATTCGATGATGATGATGA －TGAA－3′，P2：5′－GGTGGATCCCTACTCATCCTCTTTAAC－3′。 表 達(dá) 載 體p TWIN1測序鑒定引物設(shè)計，距酶切位點EcoR I上游80 bp與BamH I下游80 bp處設(shè)計兩引物，及 F：5′－TTTTTGATTTGACTGTGCCA－3′R：5′－CAAAAAACCCCTCAAGA －CCC－3′，引物由上海Sangon公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Eg AgB8/3基因分泌型多肽片段核酸序列的擴增將－80℃凍存的p ET32a－Eg AgB8/3－E.coliBL21（DE3）LysS解凍后取50μL置于EP管中，95℃煮沸10min，8 000 r/min離心15 min，收集上清。以上清為模板DNA，加入特異性引物P1、P2，PCR擴增Eg AgB8/3編碼分泌型多肽的基因片段。（1）反應(yīng)體系：PCR mix Buffer 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，模板DNA 2μL，滅菌超純水補足至總體積20μL。（2）擴增條件：95℃6 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延長10 min。（3）擴增產(chǎn)物回收：PCR產(chǎn)物目的條帶的切膠回收按DNA凝膠回收試劑盒說明書操作。

1.2.2 pEASY－T1－Eg AgB8/3重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將上述膠回收的PCR擴增產(chǎn)物與p EASY－T1載體連接，連接體系為10μL；目的基因片段PCR產(chǎn)物4μL，pEASY－T1 vector 1μL，SolutionI 5μL，25℃孵育10 min后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于預(yù)先用異丙基硫代半乳糖苷和X－Gal處理的氨芐青霉素LB平板上，同時設(shè)空質(zhì)粒陽性對照及空白板陰性對照。根據(jù)藍(lán)白斑篩選原理，從轉(zhuǎn)化平板上挑取白色單菌落，220 r/min，37℃搖菌過夜。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用PCR擴增目的片段和EcoR I、BamH I雙酶切鑒定后，將含有p EASY－T1－Eg AgB8/3重組質(zhì)粒的Trans1－T1菌液送上海生物工程有限公司測序，利用DNA man軟件和Bio Edit軟件對測序后序列進行分析。

1.2.3 p TWIN1－Eg AgB8/3原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 大量提取空質(zhì)粒p TWIN1和p EASY－T1－Eg AgB 8/3重組質(zhì)粒，分別用EcoR I和BamH I雙酶切p TWIN1和p EASY－T1－Eg AgB8/3，帶有黏性末端的Eg AgB8/3目的基因和線性化的p TWIN1載體經(jīng)DNA切膠回收試劑盒回收，按4∶1的體積建立20μL連接反應(yīng)體系：目的片段12μL，載體3μL，10×連接緩沖液2μL，T4DNA連接酶1μL，去離子水2μL，22℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至氯化鈣法制備的E.coliER 2566感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐抗性的LB平板上，37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)過夜。同時設(shè)空質(zhì)粒陽性對照及空白板陰性對照。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，220 r/min，37℃搖菌過夜。以菌液為模板進行PCR擴增鑒定，隨機挑選5個PCR擴增鑒定正確的單斑小提質(zhì)粒，委托上海生工公司測序鑒定。

1.2.4 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白的表達(dá) 用接種環(huán)挑取測序鑒定正確的重組表達(dá)載體p TWIN1－Eg AgB8/3－E.coliER2566，接種于10m L液體LB（Amp＋）培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖菌過夜。按2.0%的接種量將搖過夜的菌轉(zhuǎn)接至500m L含氨芐青霉素（50μg/m L）的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD 600≈0.6時，加入通過試驗后獲得的最佳的表達(dá)條件即終濃度為0.5 mmol/L的IPTG、35℃、誘導(dǎo)表達(dá)4 h，同時取1m L未加誘導(dǎo)劑的菌液在相同的溫度、時間培養(yǎng)作為空白對照。誘導(dǎo)后的菌液于8 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清收菌，用磷酸鹽緩沖液（PBS p H7.4）在同樣的離心條件洗滌2次，液氮快速冷凍并于μ20℃保存，第2 d用 冰 預(yù) 冷 Buffer Bl（20 mmol/L Tris－HCl；500 mmol/L NaCl；1mmol/L EDTA，p H 8.5）重懸細(xì)菌沉淀，加入蛋白酶抑制劑（PMSF），冰浴超聲后13 000 r/min離心分別取上清和沉淀，待SDS－PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白結(jié)合幾丁質(zhì)柱自剪切裂解目的蛋白r Eg AgB8/3 利用有自剪切功能的原核表達(dá)載體p TWIN1，其表達(dá)蛋白內(nèi)含肽（Ssp－DnaB－intein）是一段存在于前體蛋白中的蛋白序列，構(gòu)建目的基因于內(nèi)含肽標(biāo)簽intein1（25 k Da）上，其N末端融合有chitin binding domain（CBD），它可使融合蛋白吸附于幾丁質(zhì)（Chitin）柱上，在蛋白質(zhì)成熟加工過程中自行剪切去除，可一步獲得純的目的蛋白。實驗步驟：（1）往柱上加4 mL的幾丁質(zhì)樹脂，用40 m L的B1緩沖液以0.5～1 m L/min的速率平衡柱子。（2）以0.5～1 m L/min的速率緩慢的向柱子上加樣（超聲后收集的上清）收集流出的上清待SDS－PAGE分析，用60 m L Buffer Bl緩沖液保持以0.5～1 m L/min的速率清洗柱子。（3）用12 m L Buffer B2緩沖液（20 mmol/L Tris－HCl；500 mmol/L NaCl；1 mmol/L EDTA，p H 7.0）快速的沖洗柱子后，再用4 mL的B2緩沖液25℃孵育48 h。（4）第2 d，用總量為12 m L的Buffer B2緩沖液洗脫柱子，取樣待SDSPAGE分析融合蛋白純化的效率。

1.2.6 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白和目的蛋白r E－g AgB8/3的 Western blot鑒定 融合蛋白的 Western blot鑒定：按Invitrogen公司推薦的方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于10 m L封閉液中，37℃封閉1 h；取一抗（抗CBD的兔抗血清）以1∶5 000稀釋，4℃過夜孵育；第2 d用WesternBreeze試劑盒提供的洗膜液室溫洗滌4次，每次5 min；取WesternBreeze試劑盒提供的二抗（堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體），37℃反應(yīng)2 h；室溫洗滌4次，每次5 min；加入適量BCIP/NBT顯色液振搖至條帶清晰后，用蒸餾水終止反應(yīng)。r Eg AgB8/3蛋白的Western blot鑒定：一抗為實驗室保存的純化后的Trx－Eg AgB8/3重組蛋白兔多克隆抗體，以1∶1 000稀釋，4℃過夜孵育，二抗的孵育和顯色方法同前文。

2 結(jié) 果

2.1 Eg AgB8/3基因分泌型多肽片段核酸序列的PCR擴增結(jié)果 以重組質(zhì)粒p ET32a－Eg AgB8/3模板，P1和P2為引物擴增后，得到大小為207bp的Eg AgB8/3 DNA片段，與預(yù)測片段大小相符（圖1）。

圖1 EgAgB8/3 PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of EgAgB8/3M ：DL2 000 DNA maker；1－2：PCR products

2.2 p EASY－T1－Eg AgB8/3重組質(zhì)粒的鑒定 用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取經(jīng)藍(lán)白斑篩選的陽性克隆菌株質(zhì)粒。經(jīng)PCR擴增與EcoR I和BamH I雙酶切p EASY－T1－Eg AgB8/3重組質(zhì)粒后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定均可見酶切后得到大小約207 bp的片段，符合目的基因預(yù)期大小，測序結(jié)果與已報道的Eg AgB8/3基因（GenBank登錄號為AF362442）的序列完全一致，同源性為100%。

2.3 p TWIN1－Eg AgB8/3原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定雙 酶 切 p EASY－T1－Eg AgB8/3 重 組 質(zhì) 粒 和p TWIN1表達(dá)質(zhì)粒，并切膠回收Eg AgB8/3目的基因和p TWIN1線性化的載體大片段，T4 DNA連接酶連接，定向克隆構(gòu)建p TWIN1－Eg AgB8/3原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、小量提取質(zhì)粒后，用PCR法及EcoR I和BamH I雙酶切p TWIN1－Eg AgB8/3原核表達(dá)質(zhì)粒均可得到207 bp的DNA片段，與預(yù)期產(chǎn)物一致（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒pTWIN1－EgAgB8/3PCR及酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Conformation of p TWIN1－EgAgB8/3 recombinant plasmid by PCR and restriction enzyme digestionM：DL10 000 DNA maker；1－2：Eg AgB8/3 PCR products；3：Recombinant plasmid fragments digested by Eco R I and Bam H I

2.4 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白的表達(dá)純化鑒定 將p TWIN1－Eg AgB8/3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Eg AgB8/3－E.coliER2566感受態(tài)細(xì)胞中，接種培養(yǎng)后誘導(dǎo)4 h，菌液超聲離心后分別取上清和沉淀（圖3第3條泳道和第4條泳道）作SDS－PAGE分析，可見在33 k Da處出現(xiàn)明顯的普帶，說明融合蛋白已成功表達(dá)并為可溶性蛋白，通過融合蛋白N末端融合的CBD蛋白吸附于幾丁質(zhì)柱上，并在蛋白質(zhì)成熟加工過程中自行剪切去除，獲得高純度目的蛋白r Eg AgB8/3（如圖3第6、7、8泳道），圖3第5泳道為純化時超聲后上清蛋白樣品通過幾丁質(zhì)樹脂結(jié)合后流出的樣品，在33 k Da處沒有融合蛋白條帶，可見幾丁質(zhì)結(jié)合 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白的效率幾乎為100%。

2.5 CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白和目的蛋白r Eg AgB8/3的 Western blot鑒定 對表達(dá)后的融合蛋白進行Western blot鑒定，可以看到在30 k Da處有兩條清晰的特異性條帶，一條為33 KDa的重組蛋白，另一條為降解了的蛋白片段（圖4a），對純化后得到r Eg AgB8/3蛋白進行Western blot鑒定，可看到8 k Da處有清晰的唯一的特異性條帶（圖4b）。

圖3 融合蛋白的表達(dá)純化SDS－PAGE分析圖譜Fig.3 SDS－PAGE analysis of expressed and purified fusion proteinM：Protein molecular weight marker；1：Supernatant of uninduced bacterial lysate；2：Pellets of uninduced bacterial lysate；3：Supernatant of bacterial lysate induced by IPTG for 4h；4：Pellets of bacterial lysate induced by IPTG for 4h；5：Crude cell extract after passage over chitin beads.The precursor binds to the resin through the chitin binding domain；6－8：A fraction eluted from the chitin beads after inducing cleavage of the intein－tag.

3 討 論

棘球蚴病是棘球絳蟲寄生于人及某些動物體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重的人獸共患性疾病，呈世界性分布，我國是該病發(fā)病率最高的國家之一。瞿群［8］等通過調(diào)查研究顯示疫區(qū)家犬對細(xì)粒棘球絳蟲具有很高的感染率，且與當(dāng)?shù)鼐用窈图倚蟀x病的患病率基本保持一致，所以對犬感染Eg的監(jiān)測是了解當(dāng)?shù)匕x病流行狀況和控制效果的有效手段。

圖4 純化前、后融合蛋白和目的蛋白的Western blot鑒定結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of the fusion proteins and target protein after auto－cleavageFig.4a Fusion proteins before purificationM：Protein molecular weight marker；1－4：Fusion proteins 6，8，10 and 12μL，respectivelyFig.4b Target protein after purificationM：Protein molecular weight marker；1－4：10μL of fusion，1，2，4 and 8μg/μL，respectively

Eg AgB8/3抗原具有蟲體分泌性抗原、成蟲階段大量表達(dá)、棘球絳蟲屬特異性3個重要特點。為使其能夠成為棘球絳蟲感染犬糞抗原的ELISA夾心法檢測的特異性靶蛋白，本文構(gòu)建具剪切功能的原核表達(dá)載體p TWIN1－Eg AgB8/3，p TWIN1載體利用T7啟動子在IPTG誘導(dǎo)下實現(xiàn)高水平和嚴(yán)謹(jǐn)表達(dá)調(diào)控［9］，與其它表達(dá)載體表達(dá)的帶有特殊標(biāo)簽的重組蛋白相比，表達(dá)后的融合蛋白經(jīng)簡單后續(xù)處理即可獲得含極少額外氨基酸的可溶性目的蛋白，盡可能保證了其原有的結(jié)構(gòu)和活性，在后續(xù)目的蛋白抗原免疫動物制備抗體時，可避免因含額外蛋白標(biāo)簽產(chǎn)生非特異性抗體導(dǎo)致抗體檢測天然抗原時產(chǎn)生的交叉反應(yīng)。

p TWIN1載體表達(dá)的內(nèi)含肽（Intein）是一種蛋白剪切元件（Protein splicing element），它是一些讀框區(qū)中打斷宿主基因編碼區(qū)的序列。與內(nèi)含子（Intron）不同的是，它在翻譯后通過改變p H和溫度條件誘導(dǎo)Intein自身催化剪切裂解，使其與目的蛋白斷裂。研究中將 Eg AgB8/3 融合到Ssp－DnaB－intein（intein 1）的C端，而intein 1的N末端融合有chitin binding domain（CBD），誘導(dǎo)表達(dá)后的融合蛋白中intein 1兩端分別連接CBD結(jié)構(gòu)域和目的蛋白，表達(dá)后的融合蛋白在經(jīng)過幾丁質(zhì)柱（Chitin）純化時，通過CBD的結(jié)合域附于Chitin柱上，intein 1和目的蛋白之間進行自剪切裂解［10－12］，用相應(yīng)的洗脫液將目的蛋白洗脫，從而收集到高純度的目的蛋白，在圖3中第3條泳道33 k D左右較寬的條帶為純化前的蛋白，純化后可見第6、7、8條泳道中8KD處唯一的條帶其純度＞90%，可見此種方法純化蛋白的效率很高。由圖4分析CBD－intein1－Eg AgB8/3融合蛋白為不穩(wěn)定蛋白易降解，因此在蛋白質(zhì)的超聲的過程中應(yīng)盡可能縮短操作時間并在4℃完成分離和純化過程，同時在緩沖液中加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑和還原劑，以防止蛋白的降解。

本課題構(gòu)建的重組表達(dá)載體采用了“可誘導(dǎo)的內(nèi)含肽自身剪切”技術(shù)，使內(nèi)含肽在適當(dāng)?shù)膒 H或還原條件進行自身剪切，與其它表達(dá)載體對比無需配制不同濃度的洗脫液就可將目的蛋白在經(jīng)過親和層析后從融合表達(dá)的蛋白中分離出來，大大提高了純化效率，從而能夠更大程度上保留其天然生物活性。為后續(xù)研究Eg AgB8/3的單克隆抗體的快速制備奠定了重要的基礎(chǔ)，并有望成為細(xì)粒棘球絳蟲感染犬糞抗原的免疫學(xué)診斷的新途徑。

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