人精液抗菌多肽29肽的分離純化及活性研究分析

喻志勇

云南省西雙版納州人民醫(yī)院外二科,云南西雙版納666100

抗菌肽又稱抗生素肽,對生物生存價值很高,對生物細(xì)胞的殺菌活性很高,且對于正常細(xì)胞無不良作用,通過從生物體內(nèi)進(jìn)行提取,可以在臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重要的價值.據(jù)研究來自人體的抗菌肽較之其他生物體中提取的抗菌肽,具有明顯的優(yōu)越性,不會發(fā)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng),同樣可以應(yīng)用到臨床中,現(xiàn)已鑒別到在人的靜夜中含有40多種抗菌多肽,29肽據(jù)推測是一種新型的防御素,如果能進(jìn)行科學(xué)提取,并分離純化,將在臨床發(fā)揮重要作用[1].該文即對人精液抗菌肽29肽的分離純化以及活性進(jìn)行了探討研究,下面對該院2009-2011年所得實驗研究結(jié)果具體報道如下.

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 精液標(biāo)本在4℃下離心對精液去沉渣,取出上部分精液,并冷凍于零下26℃的環(huán)境中.精子的活性以及WBC均符合正常標(biāo)準(zhǔn).

1.1.2 菌株與試劑菌株:金黃色葡萄菌、酵母菌、綠膿桿菌、大腸桿菌以及白色念珠菌.試劑:PBS、蛋白質(zhì)、瓊脂糖、酵母提取物、三氧一酸以及水等.

1.1.3 儀器液相層析系統(tǒng),主要包括:例子交換色譜、分子篩、精子分析儀、冷凍離心機(jī)、凍干機(jī)、分離陽離子柱系統(tǒng).

1.2 分離純化方法

①對人精液提取抗菌肽粗品,并冷凍進(jìn)行保存.②陽離子交換柱進(jìn)行層析.將已經(jīng)凍干的精液活性干粉,溶解于陽離子交換柱進(jìn)行洗脫,并用收集器收集洗脫峰,低溫干燥冷凍保存,然后稀釋進(jìn)行抑菌試驗,具有抑菌性的洗脫峰即為含抗菌肽的峰.③凝膠過濾:將含有抑菌肽的洗脫峰干峰合并后溶解,使用0.45 mm膜對上柱進(jìn)行過濾,并再次進(jìn)行洗脫、收集并冷凍保存,稀釋進(jìn)行抑菌試驗,確定含有抗菌肽的峰.④將凝膠過濾柱檢測有活性的洗脫峰再度洗脫,高壓液相反相色譜儀檢測波長為215 mm.將洗脫液1mL管進(jìn)行收集并干燥冷凍保存,然后稀釋進(jìn)行抗菌試驗.

1.3 活性檢測

①分別對以上各步進(jìn)行分離純化的含抗菌肽提取物的最低抑菌濃度、抗菌譜進(jìn)行檢測.②使用瓊脂糖彌散法對不同濃度29肽的抗菌活性進(jìn)行檢測分析.③對抗菌肽溶血活性進(jìn)行檢測.

2 結(jié)果

2.1 含抗菌肽提取物的最低抑菌濃度、抗菌譜檢測

抗菌肽的提取物對金黃色葡萄菌、酵母菌、綠膿桿菌、大腸桿菌以及白色念珠菌分別均有程度不同的抑制作用,對其最低抑菌濃度以及抗菌譜進(jìn)行檢測.殺菌活性整體要優(yōu)于抗生素,對殺菌活性從低到高進(jìn)行排序,結(jié)果為:大腸桿菌(10.5 ug/mL)、綠膿桿菌(18.8 ug/mL)、金黃色葡萄菌(20.9 ug/mL)、酵母菌(37.1 ug/mL),以及白色念珠菌(41.8 ug/mL).具體結(jié)果見表1.

表1 含抗菌肽提取物的最低抑菌濃度、抗菌譜檢測結(jié)果

2.2 瓊脂糖彌散法對不同濃度29肽的抗菌活性的檢測分析

經(jīng)分析,29肽對真菌均的抑制作用很強(qiáng);對G+的抑菌活性要大于對G-的抑菌活性,由統(tǒng)計知,對綠膿桿菌的抑制活性相對最強(qiáng),對酵母菌和白色念珠菌的抑制活性相對較弱.見表2.

表2 瓊脂糖彌散法對不同濃度29肽的抗菌活性的檢測分析結(jié)果

2.3 抗菌肽的溶血活性的檢測結(jié)果

將人精液中抗菌肽的提取物進(jìn)行配制,濃度為2 mg/mL,加入20 uL 29肽,并取1mL紅細(xì)胞使用EP管加入其中.經(jīng)檢測顯示,抗菌肽溶血活性均呈現(xiàn)陰性,說明29肽不具有溶血活性.

3 討論

抗菌肽是一種具有天然免疫功能的重要介質(zhì),是效果明顯的體液免疫物質(zhì),人體的粘膜正是微生物細(xì)菌的重要侵入通道,因此,抗菌肽對于增強(qiáng)人體的免疫功能具有重要作用.同時,男性的生殖系統(tǒng)也是一種具有天然免疫功能的場所,已經(jīng)鑒定的抗菌肽多達(dá)40多種,如果能采用科學(xué)合理的方法予以分離提取并進(jìn)行純化后使用,對于臨床醫(yī)學(xué)將產(chǎn)生很重要的價值.

在分離提純中,需要進(jìn)行細(xì)致的多重步驟,該文提純先對人精液先予以粗品提制,并進(jìn)行冷凍保存,然后將冷凍的精液干粉進(jìn)行溶解,分別進(jìn)行陽離子交換柱進(jìn)行層析、凝膠過濾等,將溶解的精液干粉予以洗脫,并用收集器收集洗脫峰,低溫干燥冷凍保存,然后稀釋進(jìn)行抑菌試驗,具確定具有抑菌性的洗脫峰為含抗菌肽的峰.對于抗菌肽提取物還需進(jìn)一步進(jìn)行活性檢測,以選取出抑菌活性強(qiáng)的抗菌肽,在應(yīng)用于臨床時,能發(fā)揮最佳功效.

該文分別對含抗菌肽的提取物進(jìn)行最低抑菌濃度、抗菌譜進(jìn)行檢測,并采用瓊脂糖彌散法對不同濃度29肽的抗菌活性的檢測分析,同時對抗菌肽提取物的溶血活性予以檢測.經(jīng)檢測分析知,最低抑菌濃度、抗菌譜檢測:殺菌活性整體要優(yōu)于抗生素.其中,大腸桿菌(10.5 ug/mL)>綠膿桿菌(18.8 ug/mL)>金黃色葡萄菌(20.9 ug/mL)>酵母菌(37.1 ug/mL)>白色念珠菌(41.8 ug/mL).瓊脂糖彌散法對不同濃度29肽抗菌活性的檢測分析:29肽對真菌均的抑制作用很強(qiáng);對G+的抑菌活性要大于對G-的抑菌活性,對綠膿桿菌的抑制活性相對最強(qiáng),對酵母菌和白色念珠菌的抑制活性相對較弱.菌肽的溶血活性的檢測:抗菌肽溶血活性均呈現(xiàn)陰性,說明29肽不具有溶血活性.

由以上統(tǒng)計可知,抗菌肽抗菌能力很強(qiáng),較之抗生素明顯要具有優(yōu)勢.其中,29肽初步確定為一種新型的生物活性多肽,是一種新型的防御素.該文使用的精液中提取純化的29肽是一種陽離子抗菌肽,對多種微生物病源具有很強(qiáng)的抑制能力,且對真菌的抑制力很強(qiáng).研究分析顯示,29肽的抗菌活性和其濃度有著重要關(guān)系,濃度高則抗菌活性強(qiáng),反之,則相對較弱.如果能應(yīng)用臨床,應(yīng)根據(jù)不同濃度29肽的抗菌活性能力予以合理選取.另外,29肽對于G+的抑制效果比較明顯,而當(dāng)前臨床上針對G+菌和真菌的藥物均很少,且目前使用的藥物容易出現(xiàn)耐藥性反應(yīng).29肽的出現(xiàn)克服了舊有藥物的弊端,對于當(dāng)前呈上升趨勢的性病,以及生殖系統(tǒng)感染疾病將有很好的治療作用.

當(dāng)前將29肽應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床,還存在一定問題,最主要的是29肽容易與蛋白酶發(fā)生作用,并被蛋白酶所消化.不過,當(dāng)前在腫瘤病人的口腔黏膜炎治療中,已經(jīng)開始使用抗菌肽類藥物,臨床效果十分明顯.對于29肽的應(yīng)用,應(yīng)繼續(xù)研究探討,以爭取能克服應(yīng)用問題,使29肽盡快在臨床上發(fā)揮其重要的抗菌作用.

[1]周惠民.人精液抗菌多肽29肽的分離純化與活性分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2010(2):435-437.

[2]孫少陽.人精液抗菌多肽29肽的活性分析[D].重慶:西南大學(xué),2010.

[3]鄭大偉.人精液抗菌多肽的克隆與活性分析[D].合肥:安徽醫(yī)科大學(xué),2009.

[4]曹素江,沈懷仁,仇輝光.人精液抗菌多肽29肽的純化及活性研究[J].臨床醫(yī)學(xué)雜志,2004(6):26-29.