石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定細(xì)胞中微量金屬元素鐵、銅、錳的含量

丁 沖,謝 麗,商 澎

(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室,陜西西安710072)

石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定細(xì)胞中微量金屬元素鐵、銅、錳的含量

丁 沖,謝 麗,商 澎

(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室,陜西西安710072)

采用石墨爐原子吸收光譜法進(jìn)行細(xì)胞中微量金屬元素鐵、銅、錳含量的測(cè)定。分別針對(duì)貼壁培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1和懸浮培養(yǎng)的白血病細(xì)胞K562進(jìn)行量化分析,依據(jù)細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量進(jìn)行歸一化處理,所得結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道具有較好的一致性。該方法靈敏度高,重復(fù)性好,適用于培養(yǎng)細(xì)胞中鐵、銅、錳等微量金屬元素的定量測(cè)定,為微量金屬元素在細(xì)胞中的作用以及細(xì)胞組分研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

石墨爐原子吸收光譜法;微量金屬元素;成骨細(xì)胞;白血病細(xì)胞

化學(xué)元素在細(xì)胞生命活動(dòng)中的作用以及與癌癥的關(guān)系一直受到研究者的關(guān)注,其檢測(cè)在臨床診斷中也具有重要的作用。研究顯示鐵元素在體內(nèi)的含量與直腸癌等多種癌癥的發(fā)生呈現(xiàn)正相關(guān)[1];銅過(guò)量時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷;在癌癥轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型中觀察到錳超氧化物歧化酶的表達(dá)增加[2]。

生物樣品中金屬元素含量非常低,由于在體外常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞中數(shù)量有限導(dǎo)致對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)金屬元素含量的檢測(cè)更加困難,如鐵和銅在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中的含量分別為10～20 ng·(106cells)-1和4～8 ng·(106cells)-1[3]。另外,樣品處理過(guò)程中易發(fā)生交叉污染等,導(dǎo)致微量金屬元素的定量檢測(cè)成為具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。基于樣品量少、高靈敏度的要求,全反射X-射線光譜法、流動(dòng)注射電感藕合等離子體質(zhì)譜法和石墨爐原子吸收光譜法(GF-AAS)已成功用于培養(yǎng)細(xì)胞中微量金屬元素的檢測(cè)分析[4],在實(shí)際檢測(cè)中根據(jù)檢測(cè)元素和樣品的不同可選擇不同方法。

作者以貼壁培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1和懸浮培養(yǎng)的白血病細(xì)胞K562為研究對(duì)象,采用準(zhǔn)確、穩(wěn)定的GF-AAS方法檢測(cè)兩種細(xì)胞內(nèi)微量金屬元素鐵、銅、錳的含量,再分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和總蛋白測(cè)定,定量描述細(xì)胞內(nèi)的元素含量,擬為相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1(澳大利亞悉尼大學(xué)周虹教授惠贈(zèng));人白血病細(xì)胞K562(第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心惠贈(zèng))。

α-MEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、FBS血清,美國(guó)Hyclone公司;胰蛋白酶,美國(guó)Amresco公司;1000μg ·m L-1鐵、銅、錳標(biāo)準(zhǔn)溶液,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硝酸、氯化鈉,優(yōu)級(jí)純,西隴化工股份有限公司; BCA蛋白測(cè)試試劑盒,美國(guó)Thermo Scientific公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ)。

ZEEnit700P型原子吸收光譜儀,德國(guó)Analytik Jena公司;CO2培養(yǎng)箱,德國(guó)Heraeus公司;CKX41型倒置顯微鏡,日本Olympus公司;Biofuge Stratos型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo Scientific公司; Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司;Vicell XR型全自動(dòng)活細(xì)胞分析儀,美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)采用添加10%FBS的α-MEM基本培養(yǎng)基。人白血病細(xì)胞K562培養(yǎng)采用添加10%FBS的1640基本培養(yǎng)基。

1.2.2 樣品制備

1.2.2.1 小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1

取一定數(shù)量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,棄上清;用胰酶消化細(xì)胞,并用生理鹽水洗細(xì)胞3次,800 r·min-1離心10 min,棄洗液;第3次洗滌時(shí)記錄細(xì)胞懸浮液體積,混勻后取出1 m L用于細(xì)胞計(jì)數(shù);同時(shí)取200μL置于1.5 m L離心管中,于15 000 g、4℃離心15 min后棄上清,加入40μL細(xì)胞裂解液,室溫放置10 min后, -20℃保存用于總蛋白檢測(cè);剩余細(xì)胞懸浮液于15 000 g、4℃離心15 min后取出,棄上清,加入40μL純硝酸,混勻,60℃孵育2 h,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 人白血病細(xì)胞K562

取一定數(shù)量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,混勻收集到離心管內(nèi),800 r·min-1離心10 min,棄上清;用生理鹽水洗細(xì)胞3次,800 r·min-1離心10 min,棄洗液;第3次洗滌時(shí)記錄細(xì)胞懸浮液體積,混勻后取出1 m L用于細(xì)胞計(jì)數(shù);同時(shí)取200μL置于1.5 m L離心管中,于15 000 g、4℃離心15 min后棄上清,加入40μL細(xì)胞裂解液,室溫放置10 min后,-20℃保存用于總蛋白檢測(cè);剩余細(xì)胞懸浮液于15 000 g、4℃離心15 min后取出,棄上清,加入40μL純硝酸,混勻,60℃孵育2 h,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 原子吸收光譜儀的工作參數(shù)(表1)

表1 原子吸收光譜儀的工作參數(shù)Tab.1 Working parameters of atomic absorption spectrometer

1.2.4 原子吸收光譜儀的石墨爐參數(shù)(表2)

1.2.5 細(xì)胞中微量金屬元素含量的測(cè)定

將備用樣品溶解后加入9960μL超純水將硝酸濃度降為4‰,混勻后用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定消解細(xì)胞樣品中鐵、銅、錳元素含量,每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)和總蛋白的測(cè)定

將用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣品混勻,分別采用血球計(jì)數(shù)板和全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù),每個(gè)樣本重復(fù)計(jì)數(shù)3次。細(xì)胞總蛋白的測(cè)定采用BCA法,按照BCA蛋白測(cè)試試劑盒的步驟進(jìn)行,每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)試3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

將1000μg·m L-1鐵、銅、錳元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用4‰HNO3依次梯度稀釋至濃度為50 ng·m L-1、50 ng· m L-1、10 ng·m L-1。原子吸收光譜儀自動(dòng)將各元素的標(biāo)準(zhǔn)品按5個(gè)濃度梯度等差稀釋后進(jìn)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合數(shù)據(jù),其回歸方程見(jiàn)表3。

表2 原子吸收光譜儀的石墨爐參數(shù)Tab.2 Graphite furnace parameters of atomic absorption spectrometer

表3 鐵、銅、錳元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Tab.3 The regression equations of standard curves for elements Fe,Cu and Mn

2.2 細(xì)胞中鐵、銅、錳元素的含量

按1.2.5方法測(cè)得的是所檢測(cè)樣品的原始元素含量,不能定量反映細(xì)胞中該元素的含量。依據(jù)1.2.6方法測(cè)得的細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞總蛋白含量進(jìn)行歸一化處理,分別得出每個(gè)細(xì)胞中鐵、銅、錳元素的含量以及單位質(zhì)量細(xì)胞中各元素的含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3 細(xì)胞中鐵、銅、錳元素的加標(biāo)回收率

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,在制備的備用樣品中加入鐵、銅、錳元素的標(biāo)準(zhǔn)品20 ng·m L-1、10 ng·m L-1、2 ng·m L-1,在選定參數(shù)條件下采用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定加標(biāo)后樣本的鐵、銅、錳元素含量,計(jì)算平均回收率。結(jié)果表明,鐵、銅、錳元素的加標(biāo)回收率分別為102.5%、90.8%、105.7%,均符合相關(guān)要求。

表4 MC3T3-E1細(xì)胞和K562細(xì)胞內(nèi)鐵、銅、錳元素含量Tab.4 The contents of iron,copper and manganese in MC3T3-E1 cell and K562 cell

2.4 討論

將測(cè)得的MC3T3-E1細(xì)胞和K562細(xì)胞中鐵、銅、錳元素的含量與文獻(xiàn)報(bào)道的石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)的其它細(xì)胞中的含量進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表5[2,5]。

從表5可看出,所測(cè)的K562細(xì)胞內(nèi)鐵元素含量為58 fg·cell-1,與文獻(xiàn)報(bào)道的47.5 fg·cell-1基本一致;錳元素含量為0.073 fg·cell-1,與文獻(xiàn)報(bào)道的0.9 fg· cell-1稍有出入,這或與樣品前處理方法有關(guān)。

3 結(jié)論

采用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定了貼壁培養(yǎng)的成骨細(xì)胞MC3T3-E1和懸浮培養(yǎng)的白血病細(xì)胞K562中微量金屬元素鐵、銅、錳的含量,與文獻(xiàn)報(bào)道相比, K562細(xì)胞中鐵元素含量基本一致、錳元素含量偏低。該方法靈敏度高、重復(fù)性好,可用于培養(yǎng)細(xì)胞中鐵、銅、錳等微量金屬元素的定量測(cè)定,為微量金屬元素在細(xì)胞中的作用以及細(xì)胞自組分研究提供依據(jù)。

表5 文獻(xiàn)報(bào)道不同細(xì)胞中鐵、銅、錳元素的含量Tab.5 Literature survey on the intracellular content of iron,copper and manganese in different cell lines

[1] Huang X.Iron overload and its association with cancer risk in humans:Evidence for iron as a carcinogenic metal[J].Mutat Res, 2003,533(1-2):153-171.

[2] Jin X,Chalmers J J,Zborowski M.Iron transport in cancer cell culture suspensions measured by cell magnetophoresis[J].Anal Chem,2012,84(10):4520-4526.

[3] Szoboszlai N,Réti A,Budai B,et al.Direct elemental analysis of cancer cell lines by total reflection X-ray fluorescence[J].Spectrochim Acta B:Atomic Spectroscopy,2008,63(12):1480-1484.

[4] Szoboszlai N,Polgari Z,Mihucz V G,et al.Recent trends in total reflection X-ray fluorescence spectrometry for biological applications[J].Anal Chim Acta,2009,633(1):1-18.

[5] Polgari Z,Ajtony Z,Kregsamer P,et al.Microanalytical method development for Fe,Cu and Zn determination in colorectal cancer cells[J].Talanta,2011,85(4):1959-1965.

Determination of Contents of Trace Metal Elements Iron,Copper and Manganese in Cells by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

DING Chong,XIE Li,SHANG Peng
(Key Laboratory for Space Bioscience&Biotechnology,School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University,Xi'an 710072,China)

In this paper,the contents of trace metal elements iron,copper and manganese in cells were detected by graphite furnace atomic absorption spectrometry.For different cells including adhere-wall cultured osteoblast MC3T3-E1 and suspension cultured leukemia cell K562,the quantitative analysis was conducted by the normalization based on total number and total protein content respectively.The results showed good consistency with those of literature.In summary,this method was suitable for determination of the contents of Fe,Cu and Mn in the cultured cells with high sensitivity and good repeatability,and provided experimental basis for the research of the role of trace metal elements in cells as well as the cell components.

graphite furnace atomic absorption spectrometry;trace metal element;osteoblast;leukemia cell

O 657.31

A

1672-5425(2013)11-0071-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.11.019

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51147008),高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20126102110055)

2013-09-06

丁沖(1984-),女,陜西三原人,博士研究生,研究方向:生物電磁特性及磁場(chǎng)生物學(xué)效應(yīng),E-mail:dingchong@mail.nwpu.edu.cn;通訊作者:商澎,教授,E-mail:shangpeng@nwpu.edu.cn。