遼寧新病害核桃枝枯病病原鑒定

孫俊

摘 要： 【目的】為了對(duì)遼寧省近年發(fā)生的新病害—核桃枝枯病的病原進(jìn)行鑒定，【方法】采集遼寧省葫蘆島市建昌縣核桃枝枯病樣品，通過對(duì)病原菌形態(tài)觀察、致病性測(cè)定，以及rDNA-ITS序列分析?！窘Y(jié)果】經(jīng)分離純化獲得病原菌，通過柯赫氏法則證病，接種后出現(xiàn)的病害癥狀與直接采集到的病害標(biāo)樣癥狀一致，確定其為致病菌；對(duì)病原菌進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察，病原菌分生孢子器和分生孢子的形態(tài)與胡桃楸擬莖點(diǎn)霉較相似；將待測(cè)菌株rDNA-ITS序列與GenBank中相關(guān)菌株的ITS序列進(jìn)行同源性比較，與Phomopsis sp. （GenBank 收錄號(hào)： HM595508.1）的同源性達(dá)到99%?！窘Y(jié)論】確定遼寧地區(qū)新病害核桃枝枯病的病原菌為胡桃楸擬莖點(diǎn)霉Phomopsis juglandina。

關(guān)鍵詞： 核桃； 枝枯?。?擬莖點(diǎn)霉

中圖分類號(hào)：S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0669-03

胡桃（Juglans regial L.） 原產(chǎn)中亞，又叫核桃、羌桃、合桃等，是胡桃科核桃屬多年生落葉喬木。我國的核桃栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富。核桃仁中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物及微量元素，它還含有對(duì)人體有特殊功效的營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。醫(yī)學(xué)認(rèn)為核桃性溫、味甘、無毒，有健胃、補(bǔ)血、潤(rùn)肺、養(yǎng)神等功效[1]。20世紀(jì)90年代以來，美國等國科學(xué)家通過營養(yǎng)學(xué)和病理學(xué)研究認(rèn)為，核桃對(duì)于心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有一定的康復(fù)治療和預(yù)防效果。

而隨著核桃的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值逐漸被人們重視，核桃的種植面積越來越大，隨之而來的是病害的發(fā)生越來越嚴(yán)重。近年來，在大面積種植核桃中，核桃枯枝病各地均有發(fā)生。主要危害枝條和樹干，尤其是1～2 a生枝條易受害，一般發(fā)病株率20%～30%，嚴(yán)重的發(fā)病株率超過80%，如遇濕度太大時(shí)，引起枝條大量死亡，直接影響到樹體生長(zhǎng)，進(jìn)而影響核桃產(chǎn)量。目前國內(nèi)外對(duì)于核桃枝枯病的研究多針對(duì)矩圓黑盤孢菌Melanconium oblongum所致的枝枯病[1-2]，而對(duì)于擬莖點(diǎn)霉Phomopsis juglandina引起的核桃枝枯病在我國僅在云南昆明曾見有報(bào)道[3-4]。在烏克蘭曾有過擬莖點(diǎn)霉引起核桃枝枯病的報(bào)道[5-6]。

作者針對(duì)遼寧省核桃枝枯病進(jìn)行了病原菌分離鑒定，柯赫氏法則證病，病原菌rDNA-ITS分析，以便為搞清病害的發(fā)病規(guī)律、核桃的科學(xué)栽培管理及其防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

核桃枝枯病標(biāo)樣于2012年5月在遼寧省葫蘆島市建昌縣養(yǎng)馬甸子鄉(xiāng)平房子村采集。根據(jù)核桃枯枝危害的癥狀特點(diǎn)進(jìn)行描述記載。

1.2 病原菌鑒定

1.2.1 病菌形態(tài)特征觀察 采用常規(guī)分離方法進(jìn)行病原菌分離并純化[7]。病菌在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)，觀察并計(jì)測(cè)菌落、分生孢子器和分生孢子形態(tài)。

1.2.2 柯赫氏法則證病 選取長(zhǎng)勢(shì)一致的1 a生核桃植株，采用3種接種方法。（1）菌餅覆蓋針刺法： 在核桃枝條上用消毒的針頭刺10針，用打孔器無菌打取7 mm菌餅，將菌絲面朝向核桃枝條針刺部覆蓋。（2）孢懸液注射法： 用注射器吸取0.5 mL孢懸液（107個(gè)·mL-1）注射寄主枝條表皮中。（3）嫩枝離體接種法： 選取同一部位的嫩枝，用打孔器無菌打取7 mm菌餅，將菌絲面朝向核桃接種嫩枝切面覆蓋。接種后室溫保濕培養(yǎng)24～48 h。每種方法重復(fù)3次。跟蹤觀察致病結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀與病原菌形態(tài)觀察

2.2 柯赫氏法則證病結(jié)果

2.3 病菌ITS序列測(cè)定結(jié)果

3 討 論

國內(nèi)關(guān)于擬莖點(diǎn)霉引起的核桃枝枯病只在云南昆明有過發(fā)現(xiàn)[3]，至今再無報(bào)道，筆者首次在遼寧地區(qū)發(fā)現(xiàn)此病害，并通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定及對(duì)核桃枝枯病菌進(jìn)行rDNA-ITS序列分析相結(jié)合的方法，運(yùn)用分子和生物學(xué)雙重手段對(duì)遼寧地區(qū)核桃枝枯病菌進(jìn)行鑒定，鑒定方法方便、快速、準(zhǔn)確。

在試驗(yàn)中多次重復(fù)回接過程中發(fā)現(xiàn)，擬莖點(diǎn)霉對(duì)核桃嫩枝的侵染力較強(qiáng)，3種接種方式，病菌均可侵染。由此分析認(rèn)為病原菌極易通過傷口侵染核桃新梢，而且在溫暖多雨多霧的環(huán)境中病菌更易侵染和傳播。從試驗(yàn)結(jié)果來看，主枝接種發(fā)病的癥狀與成株期核桃樹枝條自然條件下的發(fā)病癥狀相似；而嫩枝接種后發(fā)病癥狀與成株期核桃樹枝條自然條件下發(fā)病癥狀有所差別，這可能與枝條的木質(zhì)化程度、皮層厚度、及生長(zhǎng)勢(shì)之間的差異有關(guān)。

本文針對(duì)遼寧省新見病害—核桃枝枯病病菌的研究，在病菌生物學(xué)特性研究方面尚需全面深入，病菌寄主范圍尚待測(cè)定，病菌侵染特性及其機(jī)制有待于深入研究，以便為生產(chǎn)上病害防治提供系統(tǒng)的理論依據(jù)。（本文圖版見插7）

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