浙江省葡萄炭疽菌對甲基硫菌靈和戊唑醇的抗藥性研究

陳聃　時浩杰等

摘 要： 【目的】了解浙江地區(qū)葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）對苯并咪唑類殺菌劑和甾醇脫甲基抑制劑（DMI）類殺菌劑的抗藥性現(xiàn)狀，為其防治提供依據(jù)和指導(dǎo)?！痉椒ā坎捎脜^(qū)分劑量法測定了浙江省臨安市、諸暨市和金華市的3個葡萄重要產(chǎn)區(qū)的108個葡萄炭疽病菌株對甲基硫菌靈和戊唑醇的抗藥性，并對甲基硫菌靈敏感和抗藥性菌株中的β-tubulin基因進行了擴增、測序和比較?！窘Y(jié)果】所采集菌株群體對甲基硫菌靈的抗藥性頻率為37.04%，且均為高水平抗藥性菌株（Ben HR），Ben HR對多菌靈和乙霉威表現(xiàn)雙重抗藥性，其β-tubulin基因的第200位密碼子從TTC突變?yōu)門AC，導(dǎo)致第200位氨基酸從苯丙氨酸（Phe）突變?yōu)榻j(luò)氨酸（Tyr）。所采集菌株群體共檢測到33個（30.56%）對戊唑醇表現(xiàn)低水平抗藥性的菌株?！窘Y(jié)論】浙江地區(qū)葡萄炭疽病菌對甲基硫菌靈、乙霉威產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，對DMIs類殺菌劑戊唑醇的抗藥性發(fā)展迅速。

關(guān)鍵詞： 葡萄炭疽病菌； 甲基硫菌靈； 乙霉威； 戊唑醇； 抗藥性； β-tubulin基因

中圖分類號：S663.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0665-04

葡萄是我國重要的果樹，近10年栽培面積和產(chǎn)量一直呈上升趨勢[1]。浙江省地理位置優(yōu)越，葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，到2010年，全省已有葡萄栽培面積2萬hm2以上。葡萄作為重要的果樹經(jīng)濟作物，已成為浙江省農(nóng)民增收的重要渠道。

葡萄炭疽病是葡萄上重要的真菌病害之一。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.）是引起該病的病原菌之一，有性世代屬于子囊菌亞門，子囊菌綱，球殼菌目，小叢殼屬的圍小叢殼菌（Glomerel ciagulata （Ston） Spauld et schrenk），自然條件下罕見[2]。膠孢炭疽菌的寄主廣泛，不同的專化型可以侵染多種不同的作物，如香蕉、杧果、辣椒、草莓、蘋果、桃等[2-6]，且因與寄主之間協(xié)同進化和受環(huán)境影響如農(nóng)藥等因素的作用，產(chǎn)生的變異相對較多，也較快。因此，對這些變化的跟蹤和研究也非常有必要，國內(nèi)外也有很多相關(guān)研究[4]。

目前生產(chǎn)上用于葡萄炭疽病防治的主要藥劑有苯并咪唑類的多菌靈和甲基硫菌靈，甾醇脫甲基抑制劑類（DMIs）的戊唑醇和咪鮮胺等。國內(nèi)外在很多種致病真菌上已有關(guān)于對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報道，如小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）[7-8]和灰霉病菌（Botrytis cinerea）[9]。國內(nèi)，葉佳等[10]報道的浙江省葡萄炭疽病菌已對甲基硫菌靈產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，但具體抗性機制還不清楚。葉佳等[9]報道浙江省葡萄炭疽病菌已對戊唑醇出現(xiàn)了敏感性分化，但進一步的發(fā)展情況還有待研究。

本研究定性測定了從浙江省葡萄重要產(chǎn)區(qū)采集的108株葡萄炭疽病菌株對甲基硫菌靈、多菌靈·乙霉威和戊唑醇的敏感性，并研究了葡萄上膠孢炭疽菌的對甲基硫菌靈的抗性分子機制。

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分離和鑒定

1.2 供試藥劑

1.3 對甲基硫菌靈的抗藥性檢測

1.4 甲基硫菌靈抗性菌株對多菌靈·乙霉威的雙重抗藥性測定

1.5 葡萄炭疽病菌β-tubulin基因序列的擴增和測序

選取對甲基硫菌靈的敏感性菌株和抗性菌株各4株，在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，用滅過菌的載玻片刮取菌絲，放入滅過菌的研缽中。在研缽中加入適量液氮并研磨成粉末狀。DNA提取采用真菌基因組DNA快速抽提取試劑盒（SK2082）（上海生工）。引物序列根據(jù)已經(jīng)報道的引物序列，TubGF（5-TCTCGATGT-TATCCGCCG-3），TubGR （5-TGAGCTCAGGAACACTGACG-3） [11]，由上海生工生物合成。PCR擴增采用即用PCR擴增試劑盒（上海生工）。PCR 參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，然后經(jīng)94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后 72 ℃延伸5 min[11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，割膠純化回收后，直接送上海生工測定，結(jié)果用軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.6 對DMI類殺菌劑戊唑醇的抗藥性檢測

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄炭疽病菌對甲基硫菌靈的抗藥性頻率

2.2 對多菌靈和乙霉威的雙重抗藥性

2.4 葡萄炭疽病菌對戊唑醇的抗藥性頻率

3 討 論

對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性菌株主要有兩種類型： Ben R1和Ben R2。在苯并咪唑類殺菌劑使用以前，田間菌株為Ben S，Ben S菌株對苯并咪唑類殺菌劑敏感、同時對乙霉威表現(xiàn)抗藥性（二者之間存在負(fù)交互抗藥性）；苯并咪唑類殺菌劑大量連續(xù)使用以后，田間開始出現(xiàn)Ben R1菌株。Ben R1對苯并咪唑類殺菌劑表現(xiàn)為高水平抗藥性，但對乙霉威敏感。于是多菌靈和乙霉威的復(fù)配制劑被大量用于對Ben R1的治理，田間開始出現(xiàn)Ben R2菌株[12-13]。Ben R2菌株表現(xiàn)為抗苯并咪唑類殺菌劑，同時對乙霉威表現(xiàn)抗藥性，即雙重抗藥性菌株[12]。

本研究檢測了浙江省葡萄產(chǎn)區(qū)臨安、諸暨和金華3地葡萄炭疽菌群體對苯并咪唑類殺菌劑甲基硫菌靈的抗藥性。從研究結(jié)果看，以上三地的葡萄炭疽病菌已對甲基硫菌靈產(chǎn)生了較嚴(yán)重的抗藥性，抗性頻率37.04%。膠孢炭疽菌對苯并咪唑類殺菌劑的高頻率抗性會導(dǎo)致苯并咪唑類殺菌劑對葡萄炭疽病的防治效果下降[14-15]。鑒于多菌靈和甲基硫菌靈有正交互抗性，因此認(rèn)為這三個地區(qū)在葡萄上應(yīng)減少使用苯并咪唑類藥劑。并且此類菌株對多菌靈·乙霉威也產(chǎn)生了抗性，即為雙重抗藥性菌株。說明臨安、諸暨和金華3地的葡萄炭疽菌群體對咪唑類殺菌劑已產(chǎn)生Ben R2抗性類型。

供試菌株中30.56%對戊唑醇產(chǎn)生低水平抗藥性，這與葉佳等[9]2011年采集的浙江省78個葡萄炭疽病菌株中2個菌株對戊唑醇的敏感性明顯較低的報道相比，抗性水平迅速提高，敏感性分化更為明顯，說明在浙江省此類藥劑的抗性發(fā)展較快，因此為延緩對戊唑醇抗藥性的產(chǎn)生[15]，筆者建議使用不同作用位點的殺菌劑與對此類藥劑混用或交替使用。

4 結(jié) 論

浙江省臨安、諸暨等地區(qū)葡萄炭疽病菌已對甲基硫菌靈、乙霉威產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抗藥性，抗性機制為β-Tubulin基因密碼子第200位苯丙氨酸（Phe）變?yōu)榻j(luò)氨酸（Tyr），建議該地區(qū)減少使用這兩類殺菌劑，否則會因用量過大造成環(huán)境污染；與之前報道相比，浙江省葡萄炭疽病菌對戊唑醇的抗藥性水平發(fā)展迅速，建議生產(chǎn)中盡量避免此類藥劑單一，以延緩對此類殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生。

參考文獻 References：

[1] LI Hua， FANG Yu-lin. Study on the mode of sustainable viticulture： Quality， Stability， Longevity and Beauty[J]. Science Technology， 2005， 23（9）： 20-22.

李華，房玉林. 論葡萄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展模式的目標(biāo)—優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)、長壽、美觀[J]. 科技導(dǎo)報，2005，23（9）： 20-22.

[2] LI Yang. Study on carbendazim-resistant Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc. in Liaoning[D]. Lanzhou： Gansu Agricultural University， 2009.

李洋. 遼寧葡萄炭疽病菌對多菌靈抗藥性研究[D]. 蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] KEFIALEW Y， AYALEW A. Postharvest biological control of anthracnose （Colletotrichum gloeosporioides） on mango （Mangifera indica）[J]. Postharvest Biology and Technology， 2008（50）： 8-11.

[4] THAN P，JEEWON R，HYDE K D，PONGSUPASAMIT S，MINGKOLPORN O， TAYLOR P W J. Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose on chilli （Capsicum spp.） in Thailand[J]. Plant Pathology， 2008（57）： 562-572.

[5] BERNSTEIN B， ZEHR E I， DEAN R A， SHABI E. Characteristics of Colletotrichum from peach， apple， pecan， and other hosts[J]. Plant Disease，1995， 79： 478-482.

[6] MAYMON M， ZVEIBIL A， PIVONIA S， MINZ D， FREEMAN S. Identification and characterization of benomyl-resistant and-sensitive populations of Colletotrichum gloeosporioides from Statice （Limonium spp.）[J]. Phytopathology， 2006， 96： 542-548.

[7] LU Yue-jian， ZHOU Ming-guo， YE Zhong-yin， HOLLOMON D W， Butters J A. Cloningg and characterization of β-tubulin gene fragment from carbendazim resistance stirain of Fusarium gramineamm[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2000， 30（1）： 30-34.

陸悅健，周明國，葉鐘音，Hollomon D W，BUTTERS J A. 抗苯并咪唑的小麥赤霉病菌β-tubulin 基因序列分析與特性研究[J]. 植物病理學(xué)報，2000，30（1）： 30-34.

[8] LI Hong-xia， LU Yue-jian， WANG Jian-xin， ZHOU Ming-guo. Comparisonof mutations in the β-tubulin gene that confer resistance to carbendazimin four plant pathogenic fungi[J]. Journal of Nanjing Agricultural University， 2002， 25 （3）： 41- 44.

李紅霞，陸悅健，王建新，周明國. 四種不同植物病原真菌與多菌靈抗藥性相關(guān)基因突變的比較[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，25 （3）： 41- 44.

[9] YE Jia， ZHANG Chuan-qing. Detection of sensitivity of grape anthracnose to thiophanate methyl， tebuconazole and kresoxim-methyl[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2012，14（1）： 111-114.

葉佳，張傳清. 葡萄炭疽病菌對甲基硫菌靈、戊唑醇和醚菌酯的敏感性檢測[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2012，14（1）： 111-114.

[10] ZHANG Chuan-qing， ZHANG Ya， WEI Fang-lin， LIU Shao-ying， ZHU Guo-nian. Detection of resistance of Botryotinia fuckeliana from protected vegetables to different classes of fungicides[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2006， 8（3）： 245-249.

張傳清，張雅，魏方林，劉少穎，朱國念. 設(shè)施蔬菜灰霉病菌對不同類型殺菌劑的抗性檢測[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2006，8（3）： 245-249.

[11] CHUNG Wen-hsin， CHUNG Wen-chuan， PENG Mun-tsu， Hong-Ren-yang， HUANG Jenn-wen. Specific detection of benzimidazole resistance in Colletotrichum gloeosporioides from fruit crops by PCR-RFLP[J]. N Biotechnol， 2010， 27（1）： 17-24.

[12] ZHANG C Q， LIU Y H， ZHU G N. Detection and characterization of benzimidazole resistance of Botrytis cinerea in greenhouse vegetables[J]. European Journal of Plant Pathology， 2010，126， 509-515.

[13] YOUNG J R， TOMASO-PETERSON M. Two Mutations in β-Tubulin 2 Gene Associated with Thiophanate-Methyl Resistance in Colletotrichum cereale Isolates from Creeping Bentgrass in Mississippi and Alabama[J]. Plant Disease，2010，94： 207-212.

[14] MACKENZIE S J， MERTELY J C， PERES N A. Curative and protectant activity of fungicides for control of crown rot of strawberry caused by Colletotrichum gloeosporioides[J]. Plant Disease，2009，93（8）： 815-820.

[15] DENG Wei-ping， YANG Min， DU Fei， LIU Yi-xiang， ZHANG Li-tao， YAN Ying-ying， WANG Si-qi， YANG Ji-zhong， HE Xia-hong， ZHU Shu-sheng. Sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides causing grape anthracnose to three sterol demethylation inhibitor （DMI） fungicides[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2011， 13（3）： 245-252.

鄧維平，楊敏，杜飛，劉屹湘，張麗韜，閆瑩瑩，汪思齊，楊積忠，何霞紅，朱書生. 葡萄膠孢炭疽菌對3種麥角甾醇脫甲基抑制劑類殺菌劑的敏感性[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2011，13（3）： 245-252.