蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感基線及其室內(nèi)抗藥突變體研究

范昆　曲健祿等

摘 要： 【目的】為明確蘋果主產(chǎn)區(qū)輪紋病菌對戊唑醇的敏感現(xiàn)狀，并評價蘋果輪紋病菌對戊唑醇的抗性風險，【方法】采用菌絲生長速率法，測定了51株采自山東、河北、陜西等地的蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性，并通過紫外線誘變野生敏感菌株獲得抗藥性突變體，進一步利用菌絲生長速率法測定抗性菌株對其他一些殺菌劑的交互抗性并比較其與敏感菌株之間的部分生物學(xué)特性?！窘Y(jié)果】51株蘋果輪紋病菌菌株EC50值分布于0.0111～ 0.7264 mg·L-1，平均EC50值（0.2541±0.0151） mg·L-1，其對戊唑醇的敏感性呈單峰分布，可作為將來進行田間蘋果輪紋病菌對戊唑醇抗藥性檢測的敏感性基線。通過紫外線誘變野生敏感菌株獲得9株抗性突變體，抗性倍數(shù)在11.00～67.88。抗性菌株UV- TS1-10對丙環(huán)唑等7種藥劑表現(xiàn)出了不同程度的交互抗藥性。9株抗戊唑醇突變體繼代培養(yǎng)至第9代，抗性倍數(shù)逐漸下降，表明所獲抗性不能穩(wěn)定遺傳?？顾幮酝蛔凅w的菌絲生長速率與親本菌株無明顯差異，而菌絲干重卻與親本菌株相比顯著性降低。【結(jié)論】蘋果輪紋病菌對戊唑醇具有中度至高度抗藥性風險，生產(chǎn)中需引起高度重視。

關(guān)鍵詞： 蘋果輪紋病菌； 戊唑醇； 敏感基線； 抗藥突變體

中圖分類號：S661.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0650-07

蘋果輪紋病（Apple ring rot）在中國最早于1928年發(fā)現(xiàn)于遼寧，隨著易感輪紋病品種富士在中國的大面積推廣，該病已成為近年來蘋果生產(chǎn)上危害最為嚴重的一種病害[1]，可同時危害蘋果樹的枝干和果實，且貯藏期可持續(xù)發(fā)病[2-3]，給果農(nóng)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。當前化學(xué)殺菌劑仍是防治蘋果輪紋病的主要手段，其中，戊唑醇是近年篩選出防治蘋果輪紋病的重要化學(xué)農(nóng)藥品種，該藥劑是德國拜耳公司于20世紀80年代開發(fā)的三唑類殺菌劑，90年代中期開始在中國蘋果樹上登記使用[4]。戊唑醇通過阻礙真菌麥角甾醇的生物合成而影響真菌細胞膜的形成，具有內(nèi)吸、廣譜特點[5]，對蘋果輪紋病具有良好的防治效果[1]，近年來該藥劑已成為防治蘋果輪紋病的主要殺菌劑。Leroux等[6]田間監(jiān)測到了葡萄灰霉病菌（Botryotinia fuckeliana）對戊唑醇的抗性菌株，Robbertse等[7]研究發(fā)現(xiàn)大麥上連續(xù)3年使用戊唑醇，大麥云紋病菌（Rhynchosporium secalis）對其敏感性顯著降低，Ma等[8]在連續(xù)4 a使用戊唑醇的開心果果園發(fā)現(xiàn)開心果枝枯病菌（Botryosphaeria dothidea）對戊唑醇的EC50值顯著高于由野生敏感菌株建立的敏感基線。目前，尚未見到關(guān)于蘋果輪紋病菌對戊唑醇抗藥性的系統(tǒng)報道，而抗性菌株生物學(xué)特性研究對預(yù)測抗性的發(fā)生發(fā)展，以及制定科學(xué)的病害防治策略具有重要意義。作者通過檢測蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性，建立了敏感基線，并通過紫外誘導(dǎo)獲得了抗性菌株，測定了敏感菌株與抗性菌株之間的生物學(xué)特性差異，明確該菌對戊唑醇的抗性風險，為戊唑醇的合理使用，避免或減緩該菌對戊唑醇抗性的產(chǎn)生提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 蘋果輪紋病果于2007年8—10月從山東（棲霞、沂源、蒙陰、泰山）、河北（衡水）、陜西（大荔、合陽、澄城）等地的不同行政區(qū)域且相距一定距離的未施用過戊唑醇及其他三唑類藥劑的果園內(nèi)采集，裝入干凈的小塑料袋中（每個袋子只裝一個標本），帶回實驗室分離純化，鑒定后獲得51株蘋果輪紋病菌株（Botryosphaeria dothidea）。

1.1.2 供試藥劑 98% 戊唑醇（Tebuconazole）原藥，江蘇常隆化工有限公司；98.8%嘧菌酯（Azoxystrobin）原藥，上虞穎泰精細化工有限公司；95%醚菌酯（kresoxim-methyl）原藥，山東億嘉農(nóng)化有限公司；96%異菌脲（Iprodione）原藥，江西禾益化工有限公司；97%多菌靈（Carbendazim）原藥，青島瀚生公司；96.4%丙環(huán)唑（Propiconazole）原藥，江蘇揚農(nóng)化工集團；95.8%苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）原藥，青島瀚生公司；92%氟硅唑（Flusilazole）原藥，青島瀚生公司。將多菌靈原藥溶于1 mol·L-1 HCL溶液，其余原藥溶于丙酮，制成104 mg·L-1的母液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性測定

1.4 抗性菌系遺傳穩(wěn)定性測定

將抗藥突變體菌株在無藥PDA平板上連續(xù)繼代培養(yǎng)9代，按1.2中的菌絲生長速率法測定連續(xù)繼代后第1，3，5，7，9代抗性菌株對戊唑醇的敏感性（EC50值），計算抗性倍數(shù)。根據(jù)抗性倍數(shù)的變化情況確定病原菌抗藥性狀的遺傳穩(wěn)定性（抗性倍數(shù)變化較小或基本保持不變則能穩(wěn)定遺傳，否則可能不能穩(wěn)定遺傳）。

1.5 交互抗性測定

在離體條件下，分別測定戊唑醇抗藥突變體及親本菌株對苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、多菌靈、異菌脲和代森錳鋅的敏感性，分析其有無交互抗藥性。

1.6 抗藥突變體生長量測定

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性基線建立

2.2 抗藥性突變體及抗藥性水平

2.3 抗性菌株UV- TS1-10交互抗藥性測定

采用敏感菌株TS1及其抗戊唑醇突變體UV- TS1-10測定了其對丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑、多菌靈、異菌脲、嘧菌酯、醚菌酯的敏感性（表3），結(jié)果表明，抗戊唑醇菌株UV- TS1-10對丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑3種同屬三唑類的藥劑均產(chǎn)生了不同水平的交互抗性，與敏感菌株相比，其交互抗性倍數(shù)分別達3.10倍、20.62倍、1.62倍，由此表明，戊唑醇對苯醚甲環(huán)唑可能易產(chǎn)生交互抗性?？刮爝虼季陮Χ柞啺奉愃巹┊惥咫m產(chǎn)生了一定水平的抗性，但抗性水平并不高，為1.01倍，說明抗戊唑醇菌株隨著抗性水平的提高可能也會對二甲酰亞胺類藥劑產(chǎn)生較高水平的交互抗性。抗戊唑醇菌株與苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯、醚菌酯存在負交互抗性現(xiàn)象，因此推測將戊唑醇與這3種殺菌劑混合或交替使用，將有可能延緩其抗藥性的發(fā)生。

2.4 抗藥性遺傳穩(wěn)定性測定

2.5 抗性突變體菌絲生長量測定

3 討 論

戊唑醇是1，2，4-三唑衍生物，高效、廣譜、內(nèi)吸、低毒的三唑類殺菌劑[18]，由于其獨特的作用機制，使得其對危害作物生長的多數(shù)真菌病害均有良好的防治效果，因而被廣泛使用[5]，現(xiàn)已成為防治果樹、小麥、玉米、蔬菜等作物病害的主要藥劑之一[19-20]。戊唑醇于20世紀90年代中期開始在中國蘋果樹上登記使用，研究靶標生物的敏感性基線和評估抗藥性風險，對科學(xué)制定該殺菌劑的使用策略和為監(jiān)測靶標生物群體的敏感性變化提供理論依據(jù)具有重要的應(yīng)用價值[15]。

本研究測定的采自山東、河北、陜西等省份的51個蘋果輪紋病菌菌株對戊唑醇的EC50平均值為（0.254 1±0.015 1） mg·L-1。從頻率分布看，對戊唑醇不同敏感性菌株的頻率呈連續(xù)的單峰曲線分布。因此，該平均值基本可以作為蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性基線。另外，供試菌株對戊唑醇的敏感性存在較大差異，EC50值高值約為最低值的65.4倍，分析原因可能與蘋果輪紋病菌的種群結(jié)構(gòu)[21-22]和病菌本身生理差異有關(guān)，此問題還有待進一步研究。

真菌對甾醇脫甲基類抑制劑（DMIs）的抗性是由多基因控制的，而且其抗藥突變體的適應(yīng)性差，在自然界中很難形成抗性群體，由此認為病菌對這類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的風險很低[23-24]。然而由于該類殺菌劑大量、連續(xù)使用，目前，已有田間采集菌株對戊唑醇產(chǎn)生抗性的報道，林才華等[25]從山東省草莓主產(chǎn)區(qū)采集分離的草莓枯萎病菌株中發(fā)現(xiàn)了對戊唑醇達10.54倍的抗性菌株；王英姿等[4]測定了山東省蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性，發(fā)現(xiàn)15.49%的菌株對戊唑醇已產(chǎn)生2～5倍的低水平抗藥性。對于病原菌對戊唑醇的抗性風險評估的研究，已有很多報道，劉英華等[18]利用戊唑醇對禾谷絲核菌進行多代汰選，獲得了抗性倍數(shù)達到33.4倍的抗性菌株，抗戊唑醇禾谷絲核菌對三唑酮、丙環(huán)唑、井岡霉素、福美雙和噁醚唑均具有顯著的交互抗性。Akallal 等[26]經(jīng)過室內(nèi)誘導(dǎo)獲得了對戊唑醇具有抗性的血紅叢赤殼菌Nectria haematococca，抗性菌株對其他三唑類殺菌劑均表現(xiàn)出明顯的交互抗性。葉滔等[14]通過紫外線誘導(dǎo)，獲得了8株對戊唑醇具有不同抗性水平的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）抗藥突變體，其抗性倍數(shù)最高達到186.03倍。本試驗結(jié)果表明，采自不同行政區(qū)域的蘋果輪紋病菌菌株在室內(nèi)紫外光誘變條件下，共獲得9株不同抗性水平的突變體，其中2株抗性倍數(shù)高達67.88倍、65.72倍的高抗突變體，各菌株對戊唑醇產(chǎn)生抗藥性突變的頻率和抗性發(fā)展速度不一致，這種差異可能與病菌本身生理差異和來源地用藥歷史不同等因素造成的。實驗表明，抗藥性突變體之間的菌絲生長速率與親本菌株雖無明顯差異，而菌絲干質(zhì)量卻與親本菌株相比顯著性降低，該特性可能不利于抗藥性群體的形成，同時，在脫離藥劑的情況下，繼代培養(yǎng)至第9代后，其EC50值均呈逐漸下降趨勢，表明所獲抗性可能不能穩(wěn)定遺傳，而其中UV- TS1-f、UV- TS1-10 抗性菌株的EC50值降幅相對緩慢，在轉(zhuǎn)接至第9代時抗藥性倍數(shù)仍很高，仍表現(xiàn)高水平抗性。

綜上所述，作者認為，蘋果輪紋病菌對戊唑醇的室內(nèi)抗藥性具有高度至中等風險。這不僅為抗性治理帶來了困難，也證明蘋果輪紋病菌對戊唑醇抗性風險較大，再生產(chǎn)上應(yīng)引起重視，加強抗性檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，蘋果輪紋病菌不僅對三唑類藥劑產(chǎn)生了不同水平的交互抗性，對二甲酰亞胺類藥劑異菌脲也產(chǎn)生了微弱的交互抗性現(xiàn)象，而與苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯、醚菌酯存在負交互抗性現(xiàn)象。李曉軍等[28]發(fā)現(xiàn)，不同地理來源的蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性都處在較高水平，總體上不存在明顯差異，沒有出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性亞群體。另據(jù)李曉軍等[27]報道，蘋果輪紋病菌對異菌脲仍處于相對敏感水平。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯、醚菌酯作為防治蘋果病害的新藥劑代表，應(yīng)用于防治蘋果輪紋病才剛剛起步，應(yīng)是與戊唑醇輪換使用防治蘋果輪紋病的有效藥劑。因此在推廣戊唑醇防治蘋果輪紋病時，建議加強對蘋果輪紋病菌的抗性監(jiān)測，降低使用次數(shù)及用量，提倡戊唑醇或其他三唑類藥劑與不同作用方式的藥劑輪換使用，避免三唑類藥劑間的輪換使用，以避免或延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長該藥劑的使用壽命。

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