科研成果移植為生命科學(xué)專題教學(xué)實(shí)驗(yàn)——以DNA條形碼研究為例

尚 娜，周志軍

（1.河北大學(xué) 圖書館，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是理工科高等教育的重要組成部分，是培養(yǎng)高質(zhì)量科學(xué)人才的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)依附于理論課，受限于實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)的安排，由一個(gè)個(gè)相互孤立的、小而散的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目組成。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容方面，以驗(yàn)證性為主，內(nèi)容陳舊呆板［1］。進(jìn)入21世紀(jì)，許多高校都嘗試對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，主要包括實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系、結(jié)構(gòu)、內(nèi)容進(jìn)行了改革，構(gòu)建符合素質(zhì)教育和人才發(fā)展的開放創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式［2－4］，一些學(xué)者提出將科研成果移植為實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，服務(wù)于實(shí)驗(yàn)教學(xué)［5－6］。適時(shí)地選擇一些科研成果，將其轉(zhuǎn)化為專題實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生能夠全程參與一項(xiàng)完整的科研過(guò)程，對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、分析解決問(wèn)題能力和創(chuàng)新能力具有重要意義。

1 科研成果服務(wù)生命科學(xué)專題實(shí)驗(yàn)教學(xué)舉例

1.1 專題實(shí)驗(yàn)內(nèi)容選擇

2003年，加拿大生態(tài)學(xué)家Herbert等提出DNA條形碼概念（DNA Barcoding），針對(duì)形態(tài)學(xué)分類固有的缺陷，如表型可塑性和遺傳可變性、無(wú)法鑒定隱存分類單元、不同發(fā)育階段的物種、不完整的生物體組織碎片等，Herbert倡導(dǎo)利用線粒體COⅠ基因5′端長(zhǎng)度為658bp的標(biāo)準(zhǔn)基因片段在DNA水平上進(jìn)行物種區(qū)分，構(gòu)建全球性的物種鑒別平臺(tái)［7－8］。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排

1.2.1 儀器、試劑與材料

儀器：PCR擴(kuò)增儀、冷凍高速臺(tái)式離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、微量移液器、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、恒溫金屬浴等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。

試劑：蛋白酶 K、rTaq聚合酶、dNTPs、DNA Marker、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、EB（溴化乙錠）、Na2EDTA（乙二銨四乙酸鈉鹽）、Tris平衡酚、瓊脂糖、無(wú)水乙醇、氯仿、SDS等。

材料：新鮮標(biāo)本、酒精浸泡標(biāo)本或干制針插標(biāo)本等。

1.2.2 總DNA提取

取標(biāo)本足股節(jié)肌肉，采用酚－氯仿抽提法，參考田英芳等（1999）提出的方法提取總 DNA［9］。具體步驟為：

（1）配制裂解液。A︰B︰C＝8︰1︰1（A液：0.05MTris，0.1MNaCl，0.1MNa2EDTA，pH 7.0～8.0；B液：5%SDS；C液：2mg／mL蛋白酶K）；

（2）編號(hào)。要求簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)室唯一、有一定的自明性、取材后的憑證標(biāo)本與提取所使用離心管相對(duì)應(yīng)。

（3）取材。用無(wú)菌眼科剪刀剪開后足股節(jié)表皮，用鑷子夾取適量肌肉組織放入盛有600μL裂解液的離心管中，經(jīng)剪刀反復(fù)剪碎、研磨后，加入1 μLRNA酶。

（4）消化。65℃水浴1～2h，至消化液變清亮。

（5）酚抽提。加入等體積Tris平衡酚，上下緩慢顛倒混勻，8000r／min離心10min，取上清，并重復(fù)1次。

（6）氯仿抽提。加入等體積氯仿／異戊醇混合液（24︰1），上下緩慢顛倒混勻，8000r／min離心10 min，取上清。

（7）沉淀DNA。加入2倍體積的冰無(wú)水乙醇，在冰箱中放置20min以沉淀DNA，12000r／min離心15min，棄上清；再加入1mL 70%冰乙醇洗滌DNA，12000r／min離心15min，棄上清。

（8）自然干燥后，溶解于50μL無(wú)菌雙蒸水。

（9）電泳檢測(cè)。1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，EB染色，紫外成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

選用DNA條形碼通用引物：LCO1490：5’－GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G －3’和HC02198：5’－TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA －3’進(jìn)行擴(kuò)增［10］。參考 TaKaRa rTaq聚合酶使用說(shuō)明，配置反應(yīng)體系（25μL），其中10×Buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，模板DNA 3μL，引物各3μL，酶0.25μL，加超純水補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，49℃退火20s，70℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，切取目標(biāo)條帶后使用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收后，送測(cè)序公司進(jìn)行直接測(cè)序或連接到T載體中進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序公司提供的測(cè)序結(jié)果通常是abi格式，雙向測(cè)序結(jié)果經(jīng)Lasergene 6中的SeqMan軟件進(jìn)行峰圖校正和拼接，最終以fasta格式輸出［11］。為避免核基因組中Numts干擾，首先使用Lasergene 6中的Editseq軟件［11］，選擇無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體密碼子表對(duì)序列進(jìn)行翻譯，檢測(cè)是否存在由于堿基突變、插入／缺失導(dǎo)致的翻譯意外終止的Numts；然后使用ClustalX［12］經(jīng)多重序列比對(duì)篩查存在堿基插入／缺失的Numts。最后使用 MEGA 4.0［13］計(jì)算序列的堿基組成（nucleotide composition）、變異位點(diǎn)（variable sites）、保守位點(diǎn)（conserved sites）、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony information sites）、自裔位點(diǎn)（singleton sites）、轉(zhuǎn)換與顛換的比例（Ts／Tv）、種內(nèi)及種間kimura 2－parameter距離等，并采用K2P（kimuras 2parameter）模型，以鄰接法（neibor－joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹。

2 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高等學(xué)校，特別是理工科院校教學(xué)的重要組成部分，是提高教學(xué)質(zhì)量、培養(yǎng)具有創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力的高素質(zhì)人才不可缺少的重要環(huán)節(jié)。DNA條形碼研究實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，具備很好的可操作性，綜合性強(qiáng)，適合生命科學(xué)專業(yè)高年級(jí)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。通過(guò)開設(shè)DNA條形碼研究實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)操作方面，可以使學(xué)生充分掌握DNA提取、瓊脂糖凝膠電泳、PCR擴(kuò)增、DNA瓊脂糖凝膠回收、PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序等一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技能；在數(shù)據(jù)處理方面，則可以使學(xué)生掌握引物設(shè)計(jì)、序列校對(duì)、拼接與注釋、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列提交、多重序列比對(duì)、堿基組成分析、系統(tǒng)發(fā)育樹重建等一系列分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù)處理方法。這類基于科研成果移植而來(lái)的專題實(shí)驗(yàn)教學(xué)，不但在很大程度上改變了傳統(tǒng)教學(xué)模式，更為重要的是探索出了一條創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)教學(xué)的新思路。

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