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    黃芩苷對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響

    2024-01-27 16:33:38范宏芳王孜涵馬韻翼鈕紅麗翟俊英姜李樂
    西北藥學(xué)雜志 2024年1期
    關(guān)鍵詞:顆粒細(xì)胞黃芩卵泡

    范宏芳,王孜涵,王 莉,馬韻翼,鈕紅麗,翟俊英,姜李樂

    1.河南大學(xué)附屬南陽市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,南陽 473000;2.河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,鄭州 450000

    多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種常見的內(nèi)分泌紊亂和代謝異常的婦科疾病,其主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性無排卵、卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥以及胰島素抵抗[1],多數(shù)學(xué)者認(rèn)為卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡可能是其發(fā)病的主要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷聯(lián)合二甲雙胍治療PCOS 大鼠可改善其內(nèi)分泌紊亂,抑制炎癥反應(yīng),改善胰島素抵抗和子宮內(nèi)膜損傷[3]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷聯(lián)合二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)PCOS 大鼠卵巢多囊性改變,其機(jī)制可能與抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)[4]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)。研究表明,隱丹參酮通過激活PI3K 途徑可改善PCOS 大鼠生殖機(jī)能異常[5]?;谝陨涎芯浚緦?shí)驗(yàn)通過建立PCOS 大鼠模型,探討黃芩苷對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響及對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司);電泳儀(北京六一儀器廠);低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)。

    1.2 試藥

    黃芩苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號(hào)B20570,上海源葉生物科技有限公司);脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA,武漢華美科技集團(tuán)有限公司);炔雌醇環(huán)丙孕酮片(達(dá)英-35),拜耳醫(yī)藥保健有限公司);黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,F(xiàn)SH)、睪酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司;磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化磷脂肌醇3-激酶(phospho PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化蛋白激酶B(phospho Akt,p-Akt)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體均購自美國(guó)Abcam 公司。

    1.3 動(dòng)物

    健康清潔級(jí)雌性SD 大鼠60 只,8 周齡,體質(zhì)量為180~200 g,購自北京天誠(chéng)醫(yī)藥科技有限公司,許可證號(hào)為SYXK(京)2016-0047。

    2 方法

    2.1 造模與分組

    PCOS 大鼠模型的制備:隨機(jī)選取48 只大鼠,按照0.6 g·kg-1的劑量將DHEA 經(jīng)頸背部皮下注射入大鼠體內(nèi),每日1 次,連續(xù)20 d,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠陰道涂片,若陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化,動(dòng)情周期消失即視為模型制備成功[6]。將造模成功的48 只大鼠隨機(jī)分為模型組、黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組,每組12 只。黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組大鼠分別灌胃25、50 mg·kg-1黃芩苷,陽性對(duì)照組大鼠灌胃0.339 2 mg·kg-1達(dá)英-35,對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水,每日1 次,連續(xù)3 周。

    2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)

    藥物干預(yù)結(jié)束后第2 天,尾靜脈采血2 mL,以3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為8 cm),根據(jù)ELISA 試劑盒說明書將對(duì)照品稀釋至所需質(zhì)量濃度,酶標(biāo)板設(shè)置空白孔、對(duì)照品孔和待測(cè)樣品孔,將稀釋后的對(duì)照品50 μL 置于對(duì)照品孔中,待測(cè)樣品孔中加入稀釋液40 μL,再加入待測(cè)樣品10 μL,37 ℃孵育30 min,洗滌液洗滌5 次,拍板,甩干,加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素50 μL,再加入四甲基聯(lián)苯胺50 μL,反應(yīng)15 min,置于酶標(biāo)儀上,在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。

    2.3 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色

    采血完成后,頸椎脫臼法處死大鼠,取出左側(cè)卵巢組織,置于4 g·L-1多聚甲醛中固定,脫水、包埋、切片后,用蘇木素和伊紅染液染色,中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織病理學(xué)變化。

    2.4 顆粒細(xì)胞分離

    取大鼠右側(cè)卵巢組織,生理鹽水沖洗3 次,去除多余脂肪組織,解剖鏡下用無菌注射器針頭刺破卵巢上的卵泡,釋放顆粒細(xì)胞,用生理鹽水沖洗,200 目篩過濾,以1 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,用生理鹽水將沉渣重懸,再次離心,上層細(xì)胞即為顆粒細(xì)胞[7]。

    2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(cell Counting Kit-8,CCK-8)

    調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)·mL-1,接種于96 孔板中,加入200 μL 含10 g·L-1胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,取出培養(yǎng)板,每孔加入20 μL CCK-8 溶液,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定A值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

    2.6 流式細(xì)胞儀法

    調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)·mL-1,接種于96 孔板中,加入200 μL 含培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,離心收集細(xì)胞,加入結(jié)合緩沖液500 μL 將細(xì)胞重懸,加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)和膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)各5 μL,充分混勻,避光反應(yīng)15 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

    2.7 蛋白印跡法

    收集顆粒細(xì)胞,加入放射免疫沉淀法緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer,RIPA)裂解細(xì)胞,在4 ℃條件下以12 000 r min-1離心10 min,收集上清液,二奎啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度,調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度。加蛋白樣品,120 V 恒壓進(jìn)行凝膠電泳,0.3 A 恒流進(jìn)行濕轉(zhuǎn),洗膜,脫脂奶粉室溫封閉,一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,二抗室溫孵育1 h,洗膜,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑法顯色,Image J 分析條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參灰度值。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料均以(±s)表示,多樣本計(jì)量資料比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 血清激素含量測(cè)定結(jié)果

    FSH、E2、LH 和T 含量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組FSH、E2含量降低,LH、T 含量升高(P<0.05);與模型組比較,黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組FSH 和E2 含量升高,LH 和T 含量降低(P<0.05);與黃芩苷低劑量組比較,黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組FSH、E2 含量升高,LH、T 含量降低(P<0.05);與黃芩苷高劑量組比較,陽性對(duì)照組FSH、E2 含量升高,LH、T 含量降低(P<0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠血清激素含量的比較 (n=12, ±s)Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group (n=12,±s)

    表1 各組大鼠血清激素含量的比較 (n=12, ±s)Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group (n=12,±s)

    注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與黃芩苷低劑量組比較,cP<0.05;與黃芩苷高劑量組比較,dP<0.05。

    項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP FSH/(U·L-1)6.09±1.07 2.09±0.82a 3.15±0.81ab 4.22±0.97abc 5.15±0.77abcd 35.833<0.001 E2/(pmol·L-1)130.71±7.42 36.06±5.01a 55.00±5.98ab 73.77±7.26abc 102.39±12.16abcd 267.404<0.001 LH/(U·L-1)3.44±0.45 14.94±1.64a 10.63±1.47ab 8.07±0.88abc 5.43±1.01abcd 171.950<0.001 T/(nmol·L-1)21.70±4.45 147.21±10.20a 118.30±9.18ab 84.23±8.20abc 49.33±8.82abcd 423.011<0.001

    3.2 HE 染色結(jié)果

    對(duì)照組大鼠可見黃體,未見囊狀擴(kuò)張卵泡;模型組大鼠卵巢體積增大,少見黃體,可見囊狀擴(kuò)張卵泡;黃芩苷低劑量組和高劑量組以及陽性對(duì)照組大鼠卵巢體積減小,可見黃體,囊狀卵泡擴(kuò)增不明顯。見圖1。

    圖1 HE 染色觀察卵巢組織的病理變化(×200)Fig.1 The pathological changes of ovarian tissue observed by HE staining (×200)

    3.3 CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果

    細(xì)胞存活率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞存活率降低(P<0.05);與模型組比較,黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率升高(P<0.05);與黃芩苷低劑量組比較,黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率升高(P<0.05);與黃芩苷高劑量組比較,陽性對(duì)照組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞存活率的比較(n=12, ±s)Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

    表2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞存活率的比較(n=12, ±s)Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

    注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與黃芩苷低劑量組比較,cP<0.05;與黃芩苷高劑量組比較,dP<0.05。

    項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP細(xì)胞存活率100.00%59.33%±5.35%a 69.08%±8.63%ab 82.04%±4.30%abc 93.16%±2.86%abcd 128.688<0.001

    3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

    細(xì)胞凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芩苷低劑量組比較,黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與黃芩苷高劑量組比較,陽性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見表3、圖2。

    圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate measured by flow cytometry

    表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率的比較 (n=12,±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12,±s)

    表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率的比較 (n=12,±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12,±s)

    注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與黃芩苷低劑量組比較,cP<0.05;與黃芩苷高劑量組比較,dP<0.05。

    項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP細(xì)胞凋亡率2.36%±0.66%9.18%±0.84%a 8.17%±0.82%ab 6.99%±0.77%abc 4.49%±0.92%abcd 138.887<0.001

    3.5 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

    p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與模型組比較,黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與黃芩苷低劑量組比較,黃芩苷高劑量組和陽性對(duì)照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與黃芩苷高劑量組比較,陽性對(duì)照組p-PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。PI3K 和p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖3。

    圖3 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of protein expression

    表4 各組大鼠卵巢組織中蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 (n=12, ±s)Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

    表4 各組大鼠卵巢組織中蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 (n=12, ±s)Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

    注:與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與黃芩苷低劑量組比較,cP<0.05;與黃芩苷高劑量組比較,dP<0.05。

    項(xiàng)目對(duì)照組模型組黃芩苷低劑量組黃芩苷高劑量組陽性對(duì)照組FP p-PI3K 0.98±0.04 0.11±0.02a 0.35±0.05ab 0.64±0.06abc 0.89±0.03abcd 877.820<0.001 PI3K 0.99±0.03 0.98±0.04 0.95±0.05 0.99±0.03 0.95±0.06 2.372 0.065 p-Akt 0.98±0.06 0.10±0.02a 0.42±0.06ab 0.73±0.06abc 0.86±0.05abcd 549.872<0.001 Akt 0.97±0.05 0.94±0.03 0.94±0.06 0.98±0.03 0.95±0.06 1.566 0.198

    4 討論

    卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)精細(xì)而復(fù)雜的過程,而卵巢顆粒細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用,在竇前卵泡后期,顆粒細(xì)胞出現(xiàn)FSH 受體,F(xiàn)SH 誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞芳香化酶合成,而芳香化酶可使顆粒細(xì)胞將睪酮轉(zhuǎn)化成雌激素,竇卵泡期FSH 受體大量合成,產(chǎn)生大量雌激素,從而促進(jìn)卵泡發(fā)育,形成優(yōu)勢(shì)卵泡,但顆粒細(xì)胞凋亡可阻止睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?,?dǎo)致雄激素累積,發(fā)生高雄激素血癥[8]。雄激素的大量積累造成卵泡發(fā)育阻滯,優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇出現(xiàn)障礙,大量小竇狀卵泡積聚,卵巢發(fā)生多囊狀改變[9]。由此可見,顆粒細(xì)胞凋亡可能是發(fā)生PCOS 的重要機(jī)制。且SHEN H R 等[10]研究發(fā)現(xiàn),PCOS 大鼠顆粒細(xì)胞凋亡率升高,用黃連素處理后可降低細(xì)胞凋亡率、抑制炎癥反應(yīng)、改善激素代謝異常。但是顆粒細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

    黃芩苷是一種黃酮類化合物,已有研究表明,黃芩苷可調(diào)整PCOS 大鼠激素代謝異常,改善卵巢組織病理學(xué)改變和卵泡發(fā)育,同時(shí)降低炎癥反應(yīng)[11]。黃芩苷在抑制細(xì)胞凋亡方面的作用已有很多研究,YU H 等[12]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)軸有效抑制缺氧誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡。黃芩苷還可減輕三氧化二砷誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡[13]。本研究HE 染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠可見黃體,未見囊狀擴(kuò)張卵泡;模型組大鼠卵巢體積變大,少見黃體,可見囊狀擴(kuò)張卵泡;黃芩苷低劑量組、高劑量組及陽性對(duì)照組大鼠卵巢體積變小,可見黃體,囊狀卵泡擴(kuò)增不明顯。此外,通過CCK-8 法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芩苷對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組顆粒細(xì)胞存活率降低,凋亡率升高;與模型組比較,黃芩苷低劑量組、黃芩苷高劑量組顆粒細(xì)胞存活率升高,凋亡率降低。結(jié)果表明,黃芩苷可抑制顆粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖。正常生理狀況下,卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育通過多種激素的精密調(diào)控有序進(jìn)行,包括T、LH、E2 和FSH,而PCOS 患者由于激素代謝紊亂,通常表現(xiàn)為血清T 和LH 含量升高,而E2 和FSH 含量降低[14-15]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中FSH 和E2 含量降低,而T 和LH 含量升高;黃芩苷治療后與模型組比較,大鼠血清中FSH 和E2含量升高,而T 和LH 含量降低。表明黃芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代謝異常。

    PI3K/Akt 通路在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用[16-17]。XIE F 等[18]研究發(fā)現(xiàn),褪黑素通過激活PI3K-Akt 通路抑制顆粒細(xì)胞自噬和凋亡,改善PCOS 大鼠卵巢功能障礙。YU J等[19]研究表明,黃連素通過激活PI3K/AKT 途徑對(duì)PCOS 的有益作用包括改變血清激素水平、恢復(fù)卵巢形態(tài)病變、改善胰島素抵抗、增強(qiáng)細(xì)胞活力和抑制顆粒細(xì)胞凋亡。此外,葛根素能有效降低PCOS 大鼠血糖及胰島素水平,改善胰島素抵抗,且呈濃度依賴性,其作用可能與激活PI3K/AKT/FoxO1 信號(hào)通路有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示,模型組p-PI3K 和p-Akt蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低,黃芩苷低劑量組和黃芩苷高劑量組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)水平較模型組升高。表明黃芩苷可激活PI3K/Akt 信號(hào)通路。

    綜上所述,黃芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代謝紊亂、減輕卵巢病理損傷、促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、抑制顆粒細(xì)胞凋亡,其可能是通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路發(fā)揮作用的,可為臨床治療PCOS 提供新的研究思路。

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