羊冷凍精液及輸精實(shí)用技術(shù)

李 莉

（四川省鹽邊縣桐子林鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，四川 鹽邊 617100）

1 采精

用假陰道按常規(guī)方法采集精液。采精頻率一般為連續(xù)采精2d，休息1d。在采精當(dāng)天，可連續(xù)采2次（間隔10～15min）。原精液的活力要求不低于0.8。

2 精液的稀釋、分裝與冷凍

2.1 冷凍精液稀釋液

2.1.1 綿羊冷凍精液稀釋液

Ⅰ液：葡萄糖247 mmol/L，磷酸氫二鈉10 mmol/L，果糖17mmol/L，磷酸二氫鈉10mmol/L，氯化鈉49mmol/L，青霉素G500單位/mL，氯化鉀 5 mmol/L，鏈霉素500單位/mL。Ⅱ液：加15%甘油到Ⅰ液中。

2.1.2 山羊冷凍精液稀釋液

2.1.2.1 三羥甲基檸檬酸稀釋液（Ⅰ液），三羥甲基氨基甲烷 3.319g，鏈霉素 0.05g，檸檬酸 1.821g，青霉素50 000單位，葡萄糖1 g，加蒸餾水至 100mL，pH 值 7.2。

2.1.2.2 三羥甲基檸檬酸蛋黃稀釋液（Ⅱ液），三羥甲基檸檬酸稀釋液（Ⅰ液）76%，甘油4%，蛋黃20%。

2.1.2.3 牛奶稀釋液，牛奶粉（1%含脂量）10g，青霉素50000單位，葡萄糖100 mL，鏈霉素50 mg.

2.2 細(xì)管精液的稀釋、分裝與冷凍

2.2.1 綿羊細(xì)管精液的稀釋、分裝與冷凍。采精后，將精液直接冷卻至4℃后用Ⅰ液稀釋，或先初步稀釋（用Ⅰ液）再冷卻至4℃，然后再用Ⅱ液以1∶1稀釋。稀釋后，用5mL注射器在室溫下分裝于 0.25 mL 或 0.5 mL 細(xì)管內(nèi)，并隨即用塑料珠或聚乙烯醇粉封口，置5℃溫度下4h，然后將精液冷卻到-78℃（在液氮面上方5 cm處），保存于液氮中。

2.2.2 山羊細(xì)管精液的稀釋、分裝與冷凍。將精液置于30～35℃水浴中，用三羥甲基檸檬酸緩沖液稀釋精液（精液稀釋液體積比為 1∶9），離心 10min，棄去上清液。用牛奶稀釋液（無甘油）稀釋精液至 800×106個(gè)精子/mL（30～35℃）。將樣品置于250mL燒杯，在冰箱中放置 1～2h（10℃），然后用含14%甘油的牛奶稀釋液稀釋精液至 400×106個(gè)精子/mL，平衡10 min，用5 mL注射器在室溫下分裝于 0.25 mL 或 0.5 mL 細(xì)管內(nèi)，并隨即用塑料珠或聚乙烯醇粉封口，將細(xì)管平行放入盤中，置液氮蒸汽中慢慢冷凍卻至-110℃（2min），再放入液氮中保存。

2.3 顆粒精液的冷凍

2.3.1 液氮法。先將液氮注入12磅廣口保溫瓶?jī)?nèi)，隨后放置漂浮冷凍器（用泡沫塑料及120目銅紗自制而成，直徑15cm、高3cm），銅網(wǎng)面積保持低于保溫瓶口2～3 cm，以低溫溫度計(jì)測(cè)試溫度，隨時(shí)調(diào)節(jié)漂浮冷凍器銅網(wǎng)面與液氮面的距離（約3 cm），確保銅網(wǎng)面溫度保持在-80℃左右，用滴管吸取精液，按每粒0.1 mL滴凍。加蓋停留4 min后浸入液氮，用小勺收取。精液分批冷凍第二批滴凍前，需用紗布將銅網(wǎng)面擦凈。

2.3.2 干冰法。用特制扎孔器或普通玻璃棒，在預(yù)先攤平、壓實(shí)的干冰上戳上排列整齊的小穴（直徑 0.4 cm，深 2～2.5 cm），再用滴管吸取稀釋混勻的精液，按0.1 mL容量逐穴滴凍，經(jīng)4～5mi后即可撿取，存放于液氮中。

2.4 解凍

2.4.1 顆粒精液

2.4.1.1 干解法。將精液顆粒放入滅菌小試管中（每個(gè)試管放

粒），在35～40℃水浴中融化至綠豆粒大小時(shí)，迅速取出置于手心中輕輕擦動(dòng)，借助余溫全部融化。

2.4.1.2 溫解法。將1mL解凍液裝入滅菌試管內(nèi)，置于35～40℃溫水中預(yù)熱，然后投入1粒凍精搖動(dòng)至融化，取出備用。

2.4.2 細(xì)管精液 取細(xì)管精液支，置于37℃水浴中輕搖直到變色，取出至全部融化，并立即輸精。

3 輸精

3.1 輸精方法

3.1.1 顆粒精液。采用每1 d次試情，3次輸精法。即當(dāng)天發(fā)情母羊于早晚用輸精器各輸精1次，翌日早晨再輸精1次。

3.1.2 細(xì)管精液。采用每1d 1次試情，2次輸精（早、晚間隔7～8 h），直到發(fā)情終止。

3.2 輸精標(biāo)準(zhǔn)

3.2.1 顆粒精液。解凍后精子活力不低于 0.3，輸精量應(yīng)為 0.2mL，每一輸精劑量中活精子數(shù)不少于0.9 億個(gè)。

3.2.2 細(xì)管精液。解凍后精子活力在 0.35 以上，輸精量為 0.25mL每一輸精劑量中活精子數(shù)不少于0.7 億個(gè)。