血管內(nèi)皮糖萼研究進(jìn)展

姚杏紅 曾 燁

1（中山大學(xué)腫瘤防治中心放療科，華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，廣州 510060）

2（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室，成都 610041）

心血管病嚴(yán)重危害著人類的生命健康，近年來一直高居我國居民主要疾病死亡率的榜首［1］。研究行之有效的心血管病防冶策略是國家的重大戰(zhàn)略需求。心血管系統(tǒng)是一個以心為核心，血管網(wǎng)絡(luò)遍布全身的生物力學(xué)系統(tǒng)。流體力學(xué)因素，如剪切力（shear stress）通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞力傳導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)而影響血管張力、血凝過程、免疫和炎癥反應(yīng)、血管生成與重建等功能及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞感受剪切力、將剪切力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)引起分子信號級聯(lián)反應(yīng)，最終做出應(yīng)答的機(jī)制即力傳導(dǎo)機(jī)制。力傳導(dǎo)機(jī)制是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一大焦點。

過去20年，通過研究內(nèi)皮細(xì)胞已知受體／感受器在剪切力調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能中的作用，探明了一些與力學(xué)信號傳導(dǎo)相關(guān)的內(nèi)皮結(jié)構(gòu)蛋白和受體，它們通稱為力學(xué)感受器（mechanosensor）。這些潛在的力學(xué)感受器主要包括血管內(nèi)皮糖萼（endothelial glycocalyx）、離子通道（例如Ca2＋通道）、細(xì)胞骨架（cytoskeleton）（例如微管、肌動蛋白和中間絲）、G 蛋白耦聯(lián)受體（例如白介素－8 受體CXCR1和CXCR2）、酪氨酸激酶受體（例如血管內(nèi)皮生長因子受體flk－1（fetal liver kinase 1））和粘附蛋白分子（例如血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE－cadherin），血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子－1（platelet endothelial cell adhesion molecule－1，PECAM－1）和αvβ3 整 合素）等［2－6］。這些力學(xué) 元 件分布于內(nèi)皮細(xì)胞的不同部位，其中血管內(nèi)皮糖萼附著于內(nèi)皮細(xì)胞表面與血液直接接觸。

最新研究表明，作為力學(xué)感受器家族中最新的一員，內(nèi)皮糖萼在維持正常的心血管功能中扮演著非常重要的角色。血管內(nèi)皮糖萼層的破壞與動脈粥樣硬化、肥胖、腫瘤轉(zhuǎn)移等眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。人們逐漸領(lǐng)悟到血管內(nèi)皮糖萼在生理與病理過程中的重要性，對血管內(nèi)皮糖萼的結(jié)構(gòu)與功能的研究及其調(diào)控正在成為生命科學(xué)研究中值得深入的新熱點。

1 血管內(nèi)皮糖萼的結(jié)構(gòu)

血管內(nèi)皮糖萼是血管內(nèi)皮腔側(cè)表面覆蓋著的一層多糖－蛋白質(zhì)復(fù)合物。對內(nèi)皮細(xì)胞表面的這層活性物質(zhì)的認(rèn)識可追溯到半個世紀(jì)前，1966年Luft［7］采用電子顯微鏡技術(shù)首次顯示了血管內(nèi)皮糖萼，但受技術(shù)條件限制，至今對其組成與功能等仍知之甚少。目前，研究者們總結(jié)過去十?dāng)?shù)年的研究，認(rèn)為血管內(nèi)皮糖萼主要包括蛋白聚糖（proteoglycan，PG）及其上糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）鏈等。GAG 為糖萼中含量最多的成分，主要包括：硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）和透明質(zhì)酸（hyaluronic acid或hyaluronan，HA）等三種。在血管系統(tǒng)中HS最多，占GAG 總量的50%以上。內(nèi)皮細(xì)胞頂面（apical surface）的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）主要包括跨膜syndecan 家族、糖磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）錨定的glypican家族。Syndecan家族中，內(nèi)皮細(xì)胞syndecan－1可與HS和CS結(jié)合［8］，與剪切力關(guān)系最密切［9］。Glpyican－1 是唯一在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá) 的glypican家族成員，它與syndecan－1不同，只鏈接有HS鏈，而沒有CS鏈［8］。HA 是非硫酸化的GAG，它不與PG 核心蛋白相連，與受體CD44結(jié)合。目前研究認(rèn)為，胞膜窖（caveolae）與脂筏（lipid raft）為兩種不同的膜筏（membrane raft）［10，11］，syndecan－1為跨膜蛋白，錨定于膜筏外的膜區(qū)域，而glypican－1則位于膜筏上（包括胞膜窖與脂筏）。

2 血管內(nèi)皮糖萼的功能

血管內(nèi)皮糖萼強(qiáng)烈影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，可調(diào)節(jié)血細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，為維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能所必須，它貢獻(xiàn)于血－組織通透性屏障的形成［12－14］，是血流作用力的力學(xué)感受器［10，15］，并可防止白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附［16］等，在多種生理學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)前研究認(rèn)為，糖萼的各成分維持著合成與降解的動態(tài)平衡，糖萼結(jié)構(gòu)的破壞會對其功能產(chǎn)生極大影響。糖萼的主要功能有：

（1）血管壁的選擇性通透屏障

帶負(fù)電荷的內(nèi)皮糖萼與吸附的血漿蛋白位于血液和內(nèi)皮細(xì)胞之間，通過限制液體和血漿大分子向內(nèi)皮細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運，維持體液平衡，構(gòu)成了血管壁的天然選擇性通透屏障。研究表明，大分子右旋糖酐不能透過糖萼，而小分子的則容易透過［17］。糖萼破壞后，血管壁通透性增加［18］。目前認(rèn)為，糖萼變化引起的通透性改變與細(xì)胞間連接這一影響通透性的主要結(jié)構(gòu)無關(guān)。

（2）調(diào)節(jié)血細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用

內(nèi)皮糖萼的存在，限制了白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的接觸［16，19］。糖萼破壞以后，白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用增加。目前認(rèn)為，糖萼對白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的調(diào)控與兩個方面有關(guān)：一方面與可降解糖萼的細(xì)胞外蛋白酶（Extracellular Proteases）密切相關(guān)［16，19］，主要是基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteases，MMPs）；另一方面，它掩蓋或減弱了內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子如ICAM－1等。研究表明，動脈粥樣硬化早期發(fā)生事件伴隨內(nèi)皮表面糖萼的損傷，使血管壁粘附性增加。

（3）參與力傳導(dǎo)

糖萼在內(nèi)皮細(xì)胞力學(xué)信號傳導(dǎo)中扮演著重要角色［20－23］。2003年，Weinbaum 等通過理論分析，指出糖萼的存在可將細(xì)胞表面的剪切力消弱至一個可忽略的水平，剪切力矩可通過PG（如syndecan－1）的跨膜域傳遞到膜下肌動蛋白骨架，繼而觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)分子信號級聯(lián)反應(yīng)［24］。2004年，Weinbaum 等的實驗結(jié)果進(jìn)一步表明，糖萼破壞以后，細(xì)胞骨架對剪切力的應(yīng)答被抑制，而細(xì)胞連接卻幾乎不受影響［25］。選擇性移除特定糖萼GAG 可抑制剪切力誘導(dǎo)的牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的NO 生成［26－28］。

（4）作為控制中心調(diào)節(jié)血管局部微環(huán)境穩(wěn)定

糖萼GAG 鏈形成的非均相表面（heterogeneous surface）［29］為大量血源性分子的停泊提供了可能，并通過三種途徑影響著局部微環(huán)境：一是受體或者酶及其配體在內(nèi)皮糖萼上的結(jié)合造成其局部濃度的升高，如糖萼結(jié)合有脂蛋白脂肪酶及其配體低密度脂蛋白；二是血源性分子在糖萼上的結(jié)合可能會形成局部的濃度梯度；三是酶及其激動劑或抑制劑的停泊，增加了血管內(nèi)皮糖萼的血管保護(hù)功能。

3 血管內(nèi)皮糖萼的常用研究技術(shù)

近年來，流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦熒光顯微鏡、電子顯微鏡和活體顯微術(shù)的應(yīng)用發(fā)展為內(nèi)皮糖萼結(jié)構(gòu)，特別是糖萼GAG 的深入研究提供了技術(shù)手段。綜合運用多種方法可檢測細(xì)胞表面的糖萼結(jié)構(gòu)與分布情況。

（1）電子顯微鏡

內(nèi)皮糖萼的顯示最先是利用釕紅（Ruthenium Red）染色實現(xiàn)的，其測得的厚度約為20nm。但釕紅可能會通過靜電作用影響糖萼的幾何結(jié)構(gòu)，且分子較大，難以與糖萼分子完全接觸。為了克服該缺點，使用小分子阿利新藍(lán)（Alcian Blue）作為染料，測得糖萼厚度在45～80nm，而該法的缺點則是需洗去黏附的血漿蛋白，這一過程可能使糖蛋白的核心蛋白被溶解。隨后，通過使用碳氟化合物作為鋨酸溶劑的方法更好地減少了固定對糖萼結(jié)構(gòu)的破壞，使顯示厚度達(dá)60～110nm。

（2）活體顯微術(shù)

由于電子顯微鏡法中標(biāo)本制備和染色會嚴(yán)重破壞富含水分的糖萼結(jié)構(gòu)，在20世紀(jì)70年代后期，開始使用活體定量研究為糖萼厚度測定提供間接依據(jù)。該方法將糖萼視作紅細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的“隔離層”，測定該“隔離層”的范圍間接測得糖萼厚度為數(shù)百納米。

盡管活體顯微術(shù)顯示法不會破壞糖萼完整性，但卻不能用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的研究。對于體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞表面糖萼層進(jìn)行電子顯微鏡測定時需要采用特殊處理盡可能恢復(fù)和保存糖萼層的完整性。最近，Ebong等利用冷凍電子顯微鏡技術(shù)觀察到了體外牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞上厚度為5μm 的糖萼。

（3）流式細(xì)胞術(shù)

最近，Koo和Dewey 等［9］利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面糖萼成分在流動波形剪切力長時間作用下的合成情況。該方法的優(yōu)點是靈敏度高，缺點是需要將體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分離成單個細(xì)胞，對內(nèi)皮糖萼層的破壞有待評估。

（4）激光共聚焦熒光顯微鏡

我們先前利用激光共聚焦熒光顯微鏡對內(nèi)皮糖萼的成分、結(jié)構(gòu)及其在剪切力作用下的變化進(jìn)行了研究［10，30－32］。但受顯微鏡的Z軸分辨率的限制，該方法無法準(zhǔn)確顯示糖萼的厚度。

而對于血管內(nèi)皮糖萼功能的認(rèn)識，當(dāng)前主要是通過選擇性降解酶作用糖萼的特定成分，特別是GAGs，然后分析整個細(xì)胞功能的變化。

4 剪切力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮糖萼的特異重構(gòu)

最近兩年，我們在剪切力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮糖萼結(jié)構(gòu)重建方面獲得了一些研究成果。血管內(nèi)皮糖萼在剪切力作用下的改變可分為急性改變與適應(yīng)性改變。急性改變［10］：15dyn／cm2生理剪切力作用內(nèi)皮細(xì)胞30分鐘后，部分glypican－1及其結(jié)合的HS呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象，而跨膜syndecan－1 及其上附著的HS和CS，以及部分glypican－1則固定不動。適應(yīng)性改變［32］：剪切力持續(xù)作用至24 小時后，HS 重新覆蓋細(xì)胞單層表面，這與在完全適應(yīng)條件下的大鼠與小鼠主動脈中相似［33］。同時，值得注意的還有細(xì)胞骨架的變化，30 分鐘時，肌動蛋白纖維微絲在細(xì)胞頂部和底部均有增加；而24小時后，長應(yīng)力纖維形成并主要集中分布于細(xì)胞頂部，細(xì)胞底部的肌動蛋白纖維微絲增加，但排布凌亂。利用cytochalasin D 擾亂肌動蛋白的重構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)24小時以后的HS的合成與重新分布被阻止，而前30分鐘的聚集現(xiàn)象依然明顯存在?，F(xiàn)有研究表明，肌動蛋白細(xì)胞骨架為維持胞膜窖穩(wěn)定［34］所必須，同時與syndecan－1跨膜域有相互作用［35］。上述擾亂肌動蛋白的重構(gòu)廢除了血管內(nèi)皮糖萼的適應(yīng)性重構(gòu)現(xiàn)象，其產(chǎn)生的原因似乎是cytochalasin D 僅破壞了細(xì)胞骨架與syndecan－1及胞膜窖的相互作用，但不影響脂筏。

研究表明，急性與慢性改變的剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞的力學(xué)傳導(dǎo)［36，37］與內(nèi)皮通透 性［38，39］具有不 同作用。急性改變的剪切力（15dyn／cm2 作用30 分鐘）可誘導(dǎo)NO 表達(dá)水平顯著增加［10］。急性改變的剪切力（10dyn／cm2作用30分鐘）活化細(xì)胞頂面的β1整合素［40］；阻斷β1 整合素的活化可廢除剪切力誘導(dǎo)的PI3K－Akt－eNOS信號級聯(lián)這一與NO 表達(dá)密切相關(guān)的胞內(nèi)信號通路；急性剪切力誘導(dǎo)的這些變化依賴于胞膜窖的完整性，不依賴于肌動蛋白細(xì)胞骨架。肌動蛋白細(xì)胞骨架似乎與急性改變的剪切力誘導(dǎo)的NO 無關(guān)。

綜上所述，研究血管內(nèi)皮糖萼的結(jié)構(gòu)與功能，對闡明剪切力調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的力傳導(dǎo)途徑具有重要意義。急性改變的剪切力誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮糖萼重構(gòu)與NO 的表達(dá)均不依賴肌動蛋白細(xì)胞骨架。而血管內(nèi)皮糖萼在NO 表達(dá)中有著重要作用，不可否認(rèn)，通過深入認(rèn)識血管內(nèi)皮糖萼的重構(gòu)機(jī)理，可以幫助我們更好地認(rèn)識剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NO表達(dá)的作用機(jī)理，進(jìn)而幫助我們更好地保護(hù)血管，預(yù)防和冶療心血管疾病。

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