Mir－30的研究進(jìn)展

易 韜

（四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 婦科腫瘤生物治療實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

MicroRNAs 家族是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA 分子，大多數(shù)miRNA 來自于70～90個(gè)堿基大小的單鏈RNA 前體，經(jīng)過Dicer酶加工后產(chǎn)生成熟的19～25個(gè)小核苷酸［1－4］，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，參與多種細(xì)胞過程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、器官發(fā)育、疾病發(fā)生、藥理和毒理作用等［5］。miRNAs擁有復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)miRNA 可以調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，而多個(gè)miRNAs也可以組合來調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。雖然已經(jīng)有大量針對(duì)miRNA 的研究，但是絕大部分miRNA 的生物學(xué)功能仍然有待研究。

miR－30家族是由6個(gè)位于人類1，6，和8染色體上的基因編碼，包括5 個(gè)成員，miR－30a、miR－30b、miR－30c、miR－30d、miR－30e，它們之間的序列同源性非常高。microRNA 5’端2－8個(gè)核苷酸被稱為種子序列（seed sequence），是靶標(biāo)結(jié)合最關(guān)鍵的位點(diǎn)［6］。種子序列與mRNA 轉(zhuǎn)錄目標(biāo)之間的互補(bǔ)性和mRNA 位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是靶向識(shí)別的關(guān)鍵因素［7－8］。由于miR－30家族的microRNA 的核苷酸種子序列有較高的保守性和重疊的表達(dá)模式，提示miR－30家族在生物功能上可能發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖1）［9］。已查明miR－30的家族成員與成骨細(xì)胞分化，脂肪細(xì)胞分化，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），細(xì)胞衰老，心肌基質(zhì)重構(gòu)和腫瘤相關(guān)。

圖1 miR－30家族microRNA的核苷酸種子序列的保守性

1 miR－30 與上皮細(xì)胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化間的關(guān)系

上皮細(xì)胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition）簡(jiǎn)稱EMT，是指上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特征獲得典型的間充質(zhì)細(xì)胞特性的變化的生物學(xué)過程［10－11］（圖2）。EMT 在疾病的發(fā)病機(jī)制過程中通過促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育和運(yùn)動(dòng)來促使新組織類型的產(chǎn)生，其主要的特征有細(xì)胞黏附分子減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白等，在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用［12－15］。EMT 包括三種類型。I型EMT 是原始上皮細(xì)胞的過渡到能動(dòng)間充質(zhì)細(xì)胞與胚胎形成過程中的細(xì)胞類型多樣化及器官形成相關(guān)。Ⅰ型EMT 既不引起纖維化也不誘導(dǎo)侵襲發(fā)生，并且在許多情況下，所產(chǎn)生的間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷MET 后引致次級(jí)上皮細(xì)胞產(chǎn)生。Ⅱ型EMT 涉及次級(jí)上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，與傷口愈合，組織再生和器官纖維化相關(guān)［16］。Ⅲ型EMT 發(fā)生在已經(jīng)形成的實(shí)體瘤和與轉(zhuǎn)移性腫瘤上，是一種與上皮細(xì)胞惡性腫瘤相關(guān)的表型轉(zhuǎn)化［17］。原發(fā)性上皮組織腫瘤細(xì)胞通過Ⅲ型EMT 形成具有遷移能力的間充質(zhì)細(xì)胞，隨血流轉(zhuǎn)移至不同部位，形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶。EMT 的啟動(dòng)依賴許多不同的分子過程包括轉(zhuǎn)錄因子的激活，特異性細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)，重組細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，ECM 降解酶的產(chǎn)生，以及特定微小RNA 的表達(dá)［18］。

圖2 上皮細(xì)胞在miR－30家族作用下發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

許多上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的基因被預(yù)測(cè)為miR－30的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，miR－30家族水平與人胚胎胰腺上皮細(xì)胞間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化相關(guān)［18］。另一方面，在胰島間充質(zhì)細(xì)胞去分化向產(chǎn)生激素的胰島樣細(xì)胞團(tuán)塊發(fā)展過程中miR－30家族的miRNA水平提高。根據(jù)這些研究結(jié)果，使用anti－miRNA去除miR－30導(dǎo)致上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，而miR－30異位過表達(dá)的組織維持上皮細(xì)胞表型。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，miR－30家族的miRNA 靶向間充質(zhì)的波形蛋白的mRNA 并抑制其翻譯［19］。

在心肌肥大過程中miR－30和miR－133對(duì)纖維化的作用可以通過下調(diào)來影響其靶向的系列ECM mRNA，包括膠原，原纖維蛋白和彈性蛋白mRNA。miR－30靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF－β）的下游促纖維化的分子－結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在心肌的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)變化中起重要作用［20］。在腎臟內(nèi)環(huán)境研究中，滲透調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NFAT5（TonEBP）有三個(gè)保守的miR－30的結(jié)合位點(diǎn)［21］。同樣，大量的溶質(zhì)載體（SLC）的蛋白質(zhì)中的mRNA 在它們的3＇UTR 端有miR－30的結(jié)合位點(diǎn)［22］。通過敲 除miR－30A－5P 確定轉(zhuǎn)錄因子Xlim1／Lhx1是miR－30的重要靶標(biāo)，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在老鼠和青蛙腎發(fā)育中必需［23］。

miR－30是由致癌信號(hào)如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子下調(diào)，在前列腺癌標(biāo)本中低表達(dá)。這些基因中的ETS相關(guān)基因（ERG）是最常見的癌基因。miR－30在前列腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)抑制EMT 表型從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。它也能在體外體內(nèi)抑制依賴于TMPRSS2－ERG 增殖的VCAP細(xì)胞的生長(zhǎng)［24］。在HT－29 細(xì)胞系的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化microRNA 表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，HT－29經(jīng)過TGF－β處理后建立EMT 模型，通過實(shí)時(shí)定量PCR分析，miR－30水平明顯下調(diào)［25］。

miR－30也參與肝細(xì)胞的EMT 過程。研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β1 誘導(dǎo)的EMT 過程在AML12小鼠肝細(xì)胞中當(dāng)鋅指轉(zhuǎn)錄因子SNAIL1的表達(dá)增加時(shí)，miR－30的表達(dá)顯著下調(diào)。通過計(jì)算microRNA 靶標(biāo)預(yù)測(cè)到SNAIL1 的mRNA 的3′UTR 區(qū)域有一個(gè)與miR－30保守序列匹配的位點(diǎn)。研究結(jié)果證實(shí)miR–30通過與SNAIL1的預(yù)測(cè)位點(diǎn)結(jié)合產(chǎn)生負(fù)反應(yīng)調(diào)節(jié)。更重要的是，通過細(xì)胞形態(tài)的變化和SNAIL1的表達(dá)譜，E－cadherin和其他纖維母細(xì)胞標(biāo)記物評(píng)估發(fā)現(xiàn)用miR－30b的化學(xué)合成物轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著抑制TGF－β1誘導(dǎo)的EMT 過程［26］。

在對(duì)甲狀腺癌研究中發(fā)現(xiàn)miR－200和miR－30的下降可明確區(qū)分乳頭和濾泡來源的甲狀腺癌。ATC來源的間充質(zhì)細(xì)胞中這些microRNA 的表達(dá)通過調(diào)節(jié)MET 標(biāo)志物蛋白的表達(dá)減少其入侵和誘導(dǎo)間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET）。ATC 源性細(xì)胞miR－30和／或miR－200成員控 制Smad2 和TGFBR1 的 表達(dá)的上調(diào)從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF－β 信號(hào)在MET／EMT 中的作用［27］。

2 miR－30與腫瘤的關(guān)系

研究者對(duì)4419例人體樣本（3312例癌癥，1107例良性腫瘤）microRNA（miRNA）進(jìn)行了詳細(xì)分析，研究了miRNA 表達(dá)譜，其中包括50種正常組織和51 種癌癥組織。良性腫瘤和癌癥microRNA 網(wǎng)絡(luò)顯示MIR－30處于網(wǎng)絡(luò)中心作用最為突出［28］（圖3）。

圖3 miR－30處于miRcroRNA網(wǎng)絡(luò)中心調(diào)控位置摘自Genome Res，2010，20（5）：589－99

最近的研究顯示miR－30的表達(dá)與腫瘤之間關(guān)系密切，miR－30被認(rèn)為是乳腺癌，膀胱癌，結(jié)腸癌和肺癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志［29］。事實(shí)上miR－30c的表達(dá)已被建議作為內(nèi)分泌治療雌激素受體陽性乳腺癌的預(yù)測(cè)因子［30］。miR－30家族成員在雌激素受體和孕激素受體陰性的腫瘤都是下調(diào)，這表明miR－30的表達(dá)是通過這些激素調(diào)節(jié)［31］。miR－30家族調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞在非粘附條件下生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)非粘附條件下生長(zhǎng)的親代乳腺癌細(xì)胞miRNA表達(dá)中miR－30 低表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明主要是miR－30a通過調(diào)節(jié)凋亡和增殖相關(guān)基因的表達(dá)來控制腫瘤細(xì)胞非粘附性生長(zhǎng)?？沟蛲龅鞍譇VEN能部分逆轉(zhuǎn)miR－30a過表達(dá)的影響。而miR－30a的體內(nèi)的過表達(dá)可以降低乳腺腫瘤的發(fā)展趨勢(shì)［32］。

DLL4屬于Notch 信號(hào)家族膜結(jié)合配體，在腫瘤血管發(fā)生和發(fā)展過程中起基礎(chǔ)性作用［33－34］。在血管生成的體外模型中，miR－30b在內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)導(dǎo)致新生血管數(shù)量和長(zhǎng)度增加。在斑馬魚胚胎顯微注射miR－30b化學(xué)合成物造成DLL4抑制導(dǎo)致節(jié)間血管過度萌發(fā)和背主動(dòng)脈直徑的減少。對(duì)DLL43′－UTR端使用靶點(diǎn)保護(hù)拮抗miR－30結(jié)合導(dǎo)致DLL4上調(diào)，與VEGFA信號(hào)通路敲除協(xié)同作用可抑制新生血管生成［35］。另有研究報(bào)道m(xù)iR－30a的表達(dá)通過刺激頂端細(xì)胞導(dǎo)致節(jié)間動(dòng)脈的分支增加。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR－30a直接靶向Notch配體Dll4。在人類內(nèi)皮細(xì)胞中，miR－30a下調(diào)將增加DLL4蛋白質(zhì)水平激活Notch信號(hào)通路導(dǎo)致HEY2和EFNB2（和ephrin－B2）的表達(dá)。miR－30b可以通過靶向DLL4調(diào)節(jié)血管生成［36］。

研究表明，在TRAIL－耐受的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR－30b／c和miR－21水平升高，這些miRcroRNA通過抑制功能蛋白的表達(dá)來抑制TRAIL依賴性凋亡的發(fā)生。用miR－21或miR－30b／c處理T98G敏感細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生TRAIL耐受。此外，miR－30b／c和miR－21的分別靶向caspase－3和TAp63的mRNA，而這些蛋白質(zhì)在在人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤原代細(xì)胞和肺癌細(xì)胞TRAIL耐受過程中發(fā)揮作用［37］。

細(xì)胞衰老是不可逆轉(zhuǎn)的生長(zhǎng)過程和主要的抑癌機(jī)制。miR－29和miR－30的microRNA家族在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老過程中上調(diào)并激活Rb的途徑。miR－29和miR－30和結(jié)合B－Myb蛋白3＇UTR位點(diǎn)導(dǎo)致BMyb蛋白基因表達(dá)被抑制從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老。在增殖期細(xì)胞中，miR－29和miR－30阻遏野生型BMyb蛋白3＇UTR，抑制細(xì)胞DNA的合成。miR－29和miR－30通過結(jié)合到B－Myb蛋白3＇UTR結(jié)構(gòu)域激活Rb的途徑在細(xì)胞衰老中起重要調(diào)節(jié)作用［38］。

LIN28是一種進(jìn)化上保守的RNA結(jié)合蛋白在腫瘤發(fā)生和胚胎干細(xì)胞的分化中起重要作用。let－7，miR－125，miR－9，和miR－30與LIN28的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。LIN28－陽性的腫瘤細(xì)胞與LIN28－陰性的腫瘤細(xì)胞相比較，這四個(gè)miRNA的表達(dá)水平顯著降低。研究表明在胚胎干細(xì)胞和癌細(xì)胞中這四個(gè)miRRNA 能直接抑制LIN28表達(dá)［39］。

［1］Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V：The C.elegans heterochronic gene lin－4encodes small RNAs with antisense complementarity to lin－14［J］.Cell，1993，75：843－854.

［2］Lagos－Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al：Identification of novel genes coding for small expressed RNAs［J］.Science，2001，294：853－858.

［3］Lee RC，Ambros V：An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans［J］.Science，2001，294：862－864.

［4］Ambros V：MicroRNA pathways in flies and worms.Growth，death，fat，stress，and timing ［J］.Cell，2003，113：673－676.

［5］Suh N，Blelloch R：Small RNAs in early mammalian development：from gametes to gastrulation［J］.Development，2011，138：1653－1661.

［6］Ambros V，Bartel B，Bartel DP，et al：A uniform system for microRNA annotation［J］.RNA，2003，9：277－279.

［7］Hofacker IL：How microRNAs choose their targets［J］.Nat Genet，2007，39：1191－1192.

［8］Kertesz M，Iovino N，Unnerstall U，Gaul U，Segal E，et al：The role of site accessibility in microRNA target recognition［J］.Nat Genet，2007，39：1278－1284.

［9］Ketley A，Warren A，Holmes E，et al：The miR－30microRNA family targets smoothened to regulate hedgehog signalling in zebrafish early muscle development［J］.PLoS One，2013，5；8（6）：e65170.

［10］Hay ED：An overview of epithelio－mesenchymal transforma－tion［J］.Acta Anat.（Basel），1995，154：8－20.

［11］Kalluri R，Neilson EG：Epithelial－mesenchymal transition and its implications for fibrosis［J］.J Clin Invest，2003，112：1776－1784.

［12］Yu F，Yao H，Zhu P，et al：let－7regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells［J］.Cell，2007，131：1109－1123.

［13］Yu F，Deng H，Yao H，et al：MiR－30reduction maintains self－renewal and inhibits apoptosis in breast tumor－initiating cells［J］.Oncogene，2010，29：4194－4204.

［14］Lee JM，Dedhar S，Kalluri R，et al：The epithelial－mesenchymal transition：new insights in signaling，development and disease［J］.J Cell Biol，2006，172：973－81.

［15］Kalluri R：EMT：when epithelial cells decide to become mesenchymal－like cells［J］.J Clin Invest，2009；119：1417－1419.

［16］Zeisberg M，Bottiglio C，Kumar N，et al：Bone morphogenic protein－7inhibits progression of chronic renal fibrosis associated with two genetic mouse models［J］.AM J PHYSIOL，2003，285（6）：F1060－F1067.

［17］López－Nouoa JM，Nieto MA：Inflammation and EMT：an alliance towards organ fibrosis and cancer progression［J］.EMBO，2009，1（6－7）：303－314.

［18］Kalluri R，Weinberg RA：The basics of epithelial－mesenchymal transition［J］.J Clin Invest，2009，119（6）：1420－1428.

［19］Joglekar MV，Patil D，Joglekar VM，et al：The miR－30family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells［J］.Islets，2009，1：137－147.

［20］Duisters RF，Tijsen AJ，Schroen B，et al：MiR－133and miR－30Regulate connective tissue growth factor：implications for a role of micrornas in myocardial matrix remodeling［J］.CIRC RES，2009，104（2）：170－178.

［21］Ho SN：Intracellular water homeostasis and the mammalian cellular osmotic stress response［J］.J Cell Physiol，2006，206：9－15.

［22］He L，Vasiliou K，Nebert DW：Analysis and update of the human solute carrier（SLC）gene superfamily［J］.Hum Genomics，2009，3：195－206.

［23］Agrawal R，Tran U，Wessely O：The miR－30miRNA family regulates Xenopus pronephros development and targets the transcription factor Xlim1／Lhx1［J］.Development，2009，136（23）：3927－3936.

［24］Kao CJ，Martiniez A，Shi XB，et al：miR－30as a tumor suppressor connects EGF／Src signal to ERG and EMT［J］.Oncogene，2013，3.

［25］Zhang H，Zhou YY，Wu HB，Xu XP：Aberrant expression of microRNAs involved in epithelial－mesenchymal transition of HT－29cell line［J］.Cell Biol Int，2013，37（7）：669－74.

［26］Zhang J，Zhang H，Liu J，et al：miR－30inhibits TGF－β1－induced epithelial－to－mesenchymal transition in hepatocyte by targeting Snail1.Biochem Biophys Res Commun，2012，417（3）：1100－1105.

［27］Braun J，Hoang VuC，Dralle H et al：Downregulation of microRNAs directs the EMT and invasive potential of anaplastic thyroid carcinomas［J］.Oncogene.2010Jul 22；29（29）：4237－4244.

［28］Volinia S，Galasso M，Costinean S，et al：Reprogramming of miRNA networks in cancer and leukemia［J］.Genome Res，2010，20（5）：589－599.

［29］Baffa R，F(xiàn)assan M，Volinia S，et al：MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets［J］.J Pathol，2009，219：214－221.

［30］Rodriguez－Gonzalez FG，Sieuwerts AM，Smid M，et al：MicroRNA－30cexpression level is an independent predictor of clinical benefit of endocrine therapy in advanced estrogen receptor positive breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，127：43－51.

［31］Iorio MV，F(xiàn)erracin M，Liu C，et al：MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer［J］.Cancer Res，2005，65：7065–7070.

［32］Ouzounova M，Vuong T，Ancey PB，et al：MicroRNA miR－30family regulates non－attachment growth of breast cancer cells［J］.BMC Genomics，2013，14：139.

［33］Raphael K，Gridley T：Notch signaling in the vasculature.In：Raphael K，editor.Current Topics in Developmental Biology Notch Signaling.Vol 92.Waltham，MA：Academic Press；2010.p.277－309.

［34］Phng LK，Gerhardt H：Angiogenesis：a team effort coordinated by Notch［J］.Dev Cell，2009，16（2）：196－208.

［35］Bridge G，Monteiro R，Henderson S，et al：The microRNA－30family targets DLL4to modulate endothelial cell behavior during angiogenesis［J］.Blood，2012，13，120（25）：5063－5072.

［36］Jiang Q，Lagos－Quintana M，Liu D，et al：miR－30aregulates endothelial tip cell formation and arteriolar branching ［J］.Hypertension，2013，62（3）：592－598.

［37］Quintavalle C，Donnarumma E，Iaboni M，et al：Effect of miR－21and miR－30b／c on TRAIL－induced apoptosis in glioma cells［J］.Oncogene，2013，32（34）：4001－4008.

［38］Martinez I，Cazalla D，Almstead LL，et al：miR－29and miR－30regulate B－Myb expression during cellular senescenc［J］e.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（2）：522－527.

［39］Zhong X，Li N，Liang S，et al：Identification of microRNAs regulating reprogramming factor LIN28in embryonic stem cells and cancer cells［J］.J Biol Chem，2010，285（53）：41961－41971.