增強DNA 疫苗免疫原性的研究進展＊

孟俊杰 綜述 李婉宜審校

（四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，四川 成都 610041）

DNA 疫苗又稱核酸疫苗，是上世紀90年代出現(xiàn)的繼減毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗。它是將含有編碼抗原蛋白的DNA 序列的質(zhì)粒載體作為疫苗，導(dǎo)入動物細胞后通過宿主細胞轉(zhuǎn)錄翻譯出抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，從而使宿主獲得相應(yīng)的免疫保護，以達到預(yù)防和（或）治療疾病的目的，在研究中逐漸顯示出作為第三代疫苗的優(yōu)勢。

DNA 疫苗的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾方面［1-2］：表達抗原過程與自然感染相似，以天然表位提呈，沒有表位構(gòu)象的改變，能夠更好地誘發(fā)產(chǎn)生中和性抗體；不需要再在體外表達和純化蛋白質(zhì)，制備簡單，成本低廉，運輸和保存方便；可以對新的病原變異迅速作出反應(yīng)；可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一質(zhì)粒中進行融合表達，制備多價DNA 疫苗，增強免疫效果等。研究人員還發(fā)現(xiàn)［3］，利用DNA 疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞免疫可殺死腫瘤細胞，若找到細胞惡性轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，可以構(gòu)建相應(yīng)的疫苗打破免疫耐受或是引起免疫監(jiān)視，這為抗腫瘤研究提供了新的思路。

1 DNA 疫苗免疫機制的研究現(xiàn)狀

將含有目的基因片段的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細胞以后，抗原編碼基因在宿主細胞中表達出相應(yīng)抗原，并呈遞給宿主免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。這個過程與病原生物的感染過程很類似，因此宿主可同時產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫［4-6］。

1.1 DNA 疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫

質(zhì)粒被肌細胞或者周圍其他組織細胞攝取后，外源基因表達出相應(yīng)的抗原蛋白，細胞中的水解酶將其降解為8～10個氨基酸的短肽。這些短肽片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中與MHCⅠ類分子的抗原結(jié)合槽結(jié)合成復(fù)合物，并經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運至細胞表面。CD8+T 細胞識別抗原信號并被激活，增殖分化成為細胞毒性T 細胞（CTL），CTL釋放穿孔素和顆粒酶殺死被感染的細胞，從而阻止感染的擴散。此外，CTL 還可通過產(chǎn)生細胞因子等非溶細胞機制來抑制病毒。也有人認為DNA 疫苗進入機體后，肌細胞和抗原提呈細胞均會被轉(zhuǎn)染，使CD4+與CD8+T 細胞同時被激活從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答［7］。

1.2 DNA 疫苗誘導(dǎo)的體液免疫

激活B細胞需要分泌性和外源性抗原的刺激，因而抗原進入細胞表面或間隙是被B細胞識別的前提。研究表明［7］，在抗原蛋白誘發(fā)特異性抗體產(chǎn)生的過程中，完整異源抗原展示和胞外釋放起了關(guān)鍵作用。Davis［8］等根據(jù)DNA 疫苗再次免疫后的反應(yīng)程度、范圍和破壞程度推測，抗體的產(chǎn)生可能與CTL 導(dǎo)致細胞溶解釋放抗原有關(guān)?？乖鞍妆籅淋巴細胞識別后，啟動受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，最終抗原經(jīng)水解成為免疫原性多肽，與MHCⅡ類分子結(jié)合后表達于細胞表面，激活CD4+T 細胞，并分化為Th細胞，產(chǎn)生大量細胞因子。在細胞因子的作用下。B細胞進一步活化、增殖、分化為漿細胞，開始合成并分泌抗體。

2 DNA 疫苗的優(yōu)化

雖然DNA 疫苗具有減毒疫苗、滅活疫苗等無法相比的優(yōu)點，但DNA 疫苗的動物試驗研究表明，DNA 疫苗在小動物試驗中獲得了較好的免疫效果，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高的特異性抗體，對大動物而言，DNA 疫苗的免疫效果并不理想［9］。因此，使DNA 疫苗能在人體內(nèi)誘導(dǎo)出較為理想的免疫反應(yīng)是目前DNA 疫苗研發(fā)的重點。

2.1 DNA 序列的優(yōu)化

在DNA 疫苗的構(gòu)建中，通常選擇病原體的結(jié)構(gòu)蛋白和保守蛋白編碼基因作為靶基因序列誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答，以避免病毒變異產(chǎn)生免疫逃逸。Billaut-Mu lot［10］使用能夠編碼HIV-1Nef的DNA 序列對小鼠進行初次免疫，再用HIV-1Nef蛋白加強免疫，結(jié)果顯示免疫后小鼠產(chǎn)生了較強的體液和細胞免疫反應(yīng)，對HIV 入侵有良好的保護作用。除此之外，對于易變異或者有較多血清型的病原體而言，多表位基因疫苗也是一種有效的應(yīng)對手段。使用抗原表位做免疫原，可被有多種遺傳背景的MHC分子識別、結(jié)合，從而獲得高效的呈遞。2006年，郭研等人［11］將從HBV 表面包膜蛋白和核心抗原中篩選出的一組抗原表位進行組合，構(gòu)建了目的基因片斷作為乙型肝炎特異的DNA 疫苗，用該疫苗免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了很強的特異性T 細胞反應(yīng)。目的基因的選擇是DNA 疫苗能否獲得良好免疫原性的關(guān)鍵，通過核酸序列的優(yōu)化可使DNA 疫苗的免疫效果得到明顯提高。

2.2 佐劑的優(yōu)化

2.2.1 細胞因子佐劑

細胞因子是在機體免疫系統(tǒng)受到刺激時，參與免疫應(yīng)答的細胞產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)的功能。使用細胞因子作為佐劑可增強疫苗的效果。白細胞介素2（IL-2）可促進T細胞生長分化，促進B細胞分泌抗體，增強NK 和CTL 的殺傷能力，可以作為一種天然免疫佐劑來使用。Kim 等［12］用編碼HIV env／rev、SIV／pol蛋白的DNA 疫苗和含有IL-2基因的質(zhì)粒共同免疫恒河猴，結(jié)果顯示T 細胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)得到了顯著增強。沈肖方等［13］構(gòu)建出以IL-2為佐劑的乙肝病毒前表面抗原（Pres1Ag）的真核表達載體，用基因槍免疫正常小鼠和HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果顯示80%的小鼠產(chǎn)生了抗乙肝病毒前表面抗原抗體，HBV DNA 量下降，20%的小鼠乙肝表面抗原轉(zhuǎn)陰，說明此疫苗可部分打破小鼠機體的免疫耐受。干擾素（IFN）是由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子，具有影響細胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性，也是一種比較常用的細胞因子佐劑。Guo 等［14］將干擾素基因和弓形蟲抗原DNA 用肌肉注射法免疫小鼠兩次，每次100μg，間隔2周，與單獨注射抗原DNA 的對照組相比，實驗組T 淋巴細胞和NK細胞的活性都顯著增加，IgG 抗體滴度也得到明顯提高。

2.2.2 CpG 佐劑

CpG 是以未甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸（CpG）為核心的回文序列，5′端為2個嘌呤，3′端為2個嘧啶。研究發(fā)現(xiàn)CpG 在細菌基因組中的出現(xiàn)頻率為1／16，在脊椎動物基因組中的出現(xiàn)的頻率為1／50，并且甲基化率為80%～90%。脊椎動物的免疫系統(tǒng)正是通過識別未甲基化的CpG 而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。CpG 序列進入細胞的機制尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認為它是通過細胞膜表面的一種非特異性受體進入細胞。Robert［15］發(fā)現(xiàn)CpG序列可與細胞表面的Toll樣受體9（TLR9）結(jié)合，直接激活B細胞、巨噬細胞等免疫細胞。CpG 還可誘導(dǎo)單核細胞分泌IL-12 及其它細胞因子，活化NK 細胞和IFN-γ 的分泌。Koji-ma［16］將重組有HIV 外膜蛋白基因的DNA 疫苗與CpG ODN一同接種小鼠，觀察到特異性細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答均明顯增強。Lipford等［17］研究發(fā)現(xiàn)弱免疫原蛋白OVA 與CpG ODN 一起免疫小鼠，IgG2a的含量顯著增加了100倍，初始的CTL反應(yīng)也得到增強。Weiner［18］等報道用CpG 序列的DNA作為免疫佐劑和一種淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫后的小鼠能夠抵抗攻毒實驗，而且CpG 佐劑的毒性遠低于完全福氏佐劑。

3 接種方式的優(yōu)化

目前，核酸疫苗的主要免疫接種途徑有肌肉注射、粘膜表面涂布、基因槍及腹腔注射等。

3.1 肌肉注射

肌肉被認為是最有效攝取外源基因的組織，肌肉注射也是目前應(yīng)用最廣泛的免疫方式［19-20］。肌細胞可以通過T 小管或溝隙攝取外源DNA 分子，能夠長期表達外源基因，引起MHCI型免疫反應(yīng)，并且肌細胞的DNA 表達能力強于其他細胞［21-23］。但由于肌肉中缺少巨噬細胞等抗原提呈細胞，其抗原提呈能力差，注入的疫苗載體轉(zhuǎn)染率偏低。因此，肌肉接種獲得的免疫力通常隨免疫次數(shù)逐漸增加。

3.2 粘膜免疫

粘膜是大多數(shù)病原體入侵的場所，粘膜抗感染保護作用的產(chǎn)生依賴于粘膜局部和系統(tǒng)的免疫反應(yīng)。粘膜相關(guān)性淋巴樣組織（Mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）是機體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，它作為機體的防御屏障，能夠保護機體免受外源性分子的損害。當(dāng)MALT 接觸大量外源抗原時往往會選擇適宜的效應(yīng)機制調(diào)，以避免過強的免疫反應(yīng)造成自身組織的損傷。粘膜免疫不僅誘導(dǎo)粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生sIgA，還可以誘導(dǎo)全身特異性免疫，與其他途徑相比，其免疫效果明顯增強，副作用也較小。

粘膜免疫途徑主要包括滴鼻，吸入，口服，直腸給藥等，這種非侵入的免疫方式操作簡便，無創(chuàng)傷，用藥安全。近年來，粘膜免疫途徑逐漸引起人們的重視。目前很多核酸疫苗如編碼流感病毒血凝素的核酸疫苗、編碼HIV-1包膜糖蛋白的核酸疫苗等經(jīng)常直接通過鼻腔或陰道途徑進行粘膜免疫［24］。Fenne-lly等［25］以減毒鼠傷寒桿菌作為載體將編碼李斯特菌ActA 和溶胞素的兩種基因通過口服免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生了顯著的抗李斯特菌的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)。

3.3 基因槍

又稱微彈轟擊法，是指將含有目標基因的質(zhì)粒包裹在金或鎢顆粒上，利用高壓加速裝置將顆粒直接射入靶細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移［26］。該方法可迅速方便地轉(zhuǎn)移基因，且不論細胞處于靜止期還是分裂期均可進行基因轉(zhuǎn)移。與肌肉注射法相比，基因槍所需DNA 量要少得多。Fynan等［27］用基因槍法將甲型流感病毒的DNA 疫苗免疫小鼠，對比發(fā)現(xiàn)僅用0.4μg的DNA 免疫2次即可使90%的小鼠抵抗隨后的病毒攻擊，而肌內(nèi)注射則需要100μg的劑量。沈肖方［12］等用基因槍肌注人IL-2和乙肝病毒前表面抗原的真核表達載體，與正常肌肉注射和皮下注射相比，100%小鼠在第4～6周測到了抗乙肝病毒前表面抗原抗體，且該抗體持續(xù)了10周左右，所需質(zhì)粒量也僅為后者的1／10。但是由于基因槍對設(shè)備要求比較高而沒有在實驗中得到廣泛運用。

3.4 腹腔注射

腹腔內(nèi)有大量巨噬細胞，注入疫苗后可以迅速引起免疫應(yīng)答，但是由于應(yīng)答維持時間較短，轉(zhuǎn)染效率低，獲得的免疫保護效果比較差。

3.5 多途徑聯(lián)合免疫

研究表明［5］，多種途徑聯(lián)合免疫獲得的免疫效果大于僅使用一種途徑。如用疫苗進行初次免疫，重組病毒苗二次免疫，亞單位疫苗三次免疫可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度抗體。注射疫苗之前，先用蔗糖溶液對接種部位進行預(yù)處理也能提高免疫應(yīng)答水平。Fynan等［27］比較了甲型流感病毒DNA 疫苗經(jīng)不同途徑接種的免疫效果和保護率，結(jié)果無論是小鼠還是雞，其免疫效果均以多種途徑聯(lián)合免疫為最好。

4 結(jié)語

DNA 疫苗是新型疫苗的發(fā)展趨勢，眾多研究表明流感病毒DNA 疫苗的免疫效果良好，其保護效果不遜于傳統(tǒng)滅活疫苗。DNA 疫苗不僅有希望為現(xiàn)今難以治愈的感染性疾病提供有效的免疫保護，也可能在抗腫瘤方面發(fā)揮獨特的作用。目前DNA 疫苗的潛在應(yīng)用性得到廣泛認可，美國已批準瘧疾核酸疫苗的生產(chǎn)。雖然很多DNA 疫苗還處在實驗室研究和Ⅰ期臨床實驗階段，距離應(yīng)用于臨床還有漫長而艱難的道路，然而隨著對疫苗的進一步研究，核酸疫苗將成為人類與感染性疾病及腫瘤抗爭的重要武器。

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