COL4A1/A2基因變異與出血性腦血管病及梗死后出血轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

索閱，李偉，王擁軍

出血性腦血管病是腦血管病中致殘率、致死率高的類型，血腦屏障破壞參與了腦出血的發(fā)病、血腫擴(kuò)大、顱內(nèi)壓增高等病理過程。基底膜成分的異常間接提示著血腦屏障的破壞。4型膠原作為基底膜的重要組成部分，是許多出血性腦血管病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中血腦屏障破壞的觀測(cè)指標(biāo)之一。COL4A1/A2基因的變異可導(dǎo)致穿通腦、COL4A1/A2相關(guān)性腦血管病或遺傳性血管病、腎病、動(dòng)脈瘤和肌肉痙攣綜合征，并且與散發(fā)性深部腦出血、反復(fù)腦出血存在相關(guān)性。研究COL4A1/A2基因變異與腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、梗死后出血轉(zhuǎn)化為代表的散發(fā)性出血性腦血管病的相關(guān)性，將有助于出血性腦血管病針對(duì)性治療和發(fā)病后的出血控制。

1 出血性腦血管病及其危害

出血性腦血管病主要包括腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血及梗死后出血轉(zhuǎn)化。患病人群預(yù)后較差，給社會(huì)帶來較大負(fù)擔(dān)。2013年一項(xiàng)中國卒中類型的流行病學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn)中國人群與白種人人群（6%～20%）相比，總體上腦出血占所有類型腦血管病的比例更高（17%～51%）[1]。全球疾病負(fù)擔(dān)（Global Burden of Disease，GBD）研究估計(jì)2010年全球新發(fā)出血性卒中事件的發(fā)病率為81.52/100 000（95%CI72.27～92.82）[2]。腦出血的幸存者仍有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，尤其對(duì)于潛在病因不明的患者。一項(xiàng)納入多項(xiàng)觀察性研究的系統(tǒng)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性腦出血的年風(fēng)險(xiǎn)率為2.0%～2.4%，第一年的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)1.8%～7.4%[3]。

在世界衛(wèi)生組織的研究中，中國動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病率為2.0/100 000[4]。而且1/4動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者死亡，約一半的幸存者遺留一些永久性神經(jīng)功能缺損。

出血轉(zhuǎn)化可發(fā)生在10%～40%的缺血性卒中患者中，增加卒中的致殘率及致死率。

2 COL4基因變異

單核苷酸多態(tài)性變異、可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列、轉(zhuǎn)座子的有/無以及結(jié)構(gòu)變異在基因組中分布密度較大，被認(rèn)為是導(dǎo)致個(gè)體間表型差異、各種遺傳性疾病及疾病易感性的重要原因[5]。研究一些已知單基因遺傳的腦血管病對(duì)發(fā)現(xiàn)散發(fā)腦血管病致病機(jī)制有一定啟示作用。臨床研究的分子層面上，人群中某一染色體位點(diǎn)或基因的常見、少見或罕見變異與表型的研究有助于發(fā)現(xiàn)散發(fā)性腦血管病發(fā)病機(jī)制。多項(xiàng)病例報(bào)道及基礎(chǔ)、臨床研究發(fā)現(xiàn)COL4基因與出血性腦血管病關(guān)系密切。

2.1 基因變異的分類與定義 人類基因組中常見的遺傳變異類型主要有單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）變異和拷貝數(shù)變異（copy number variant，CNV）。SNP是指染色體基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失[5]。

SNP由于其二態(tài)性、分布廣泛而成為研究個(gè)體間表型差異、不同群體和個(gè)體對(duì)疾病易感性的研究熱點(diǎn)?；诔Ｒ娂膊?常見變異模型（common disease/common variant，CDCV）和經(jīng)典疾病異質(zhì)性假說中間的中立假說，最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.01的SNP可能導(dǎo)致＞90%的個(gè)體間基因異質(zhì)，繼而很大程度上導(dǎo)致表型的異質(zhì)[6]。常見變異是指MAF介于0.05～0.5之間的基因變異，少見變異是指MAF介于0.01～0.05之間的變異，罕見變異是指MAF＜0.01的變異。

2.2 膠原4基因及產(chǎn)物 4型膠原占基底膜（basement membrane，BM）成分的50%左右[7-8]。在哺乳動(dòng)物中，膠原4蛋白是由6種不同且相互關(guān)聯(lián)的膠原4a蛋白基因——COL4A1到COL4A6分別編碼的。其中a1（Ⅳ）蛋白和a2（Ⅳ）蛋白是典型膠原4分子的a蛋白，具有物種間高度保守性。其蛋白產(chǎn)物幾乎出現(xiàn)于所有基底膜組織中[9]。人類的COL4A1和COL4A2基因位于第13號(hào)染色體。包括增強(qiáng)子在內(nèi)的額外調(diào)節(jié)元件位于COL4A1和COL4A2的第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，在雙向啟動(dòng)子啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄過程中必不可少[10-12]，并有報(bào)道COL4A2下游存在靜息子[12]。順式調(diào)節(jié)元件之間的相互作用調(diào)節(jié)人類COL4A1和COL4A2基因的轉(zhuǎn)錄，保證組織特異性和表達(dá)產(chǎn)物蛋白分泌的水平與比例[13-14]。COL4A1和COL4A2以5’端相鄰，之間間隔127 bp的片段，為共用的雙向、結(jié)構(gòu)特殊的啟動(dòng)子區(qū)。編碼的前膠原蛋白多肽鏈包含成膠原結(jié)構(gòu)域，以甘氨酸-X-Y的形式重復(fù)排列，即每3個(gè)氨基酸即有一個(gè)甘氨酸出現(xiàn)。A1和A2鏈以A1A1A2的方式構(gòu)成異源三聚體，并通過鏈間結(jié)構(gòu)域的相互作用最終交聯(lián)稱為超分子4型膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。4型膠原對(duì)BM的構(gòu)成、介導(dǎo)BM與細(xì)胞間的相互作用、維持其穩(wěn)定性起到重要作用。

2.3 膠原4基因變異相關(guān)單基因遺傳腦血管COL4A1/A2相關(guān)的小動(dòng)脈病是一類可嬰兒期或成年期起病的具有神經(jīng)系統(tǒng)、全身系統(tǒng)性表現(xiàn)的疾病，與COL4A1突變相關(guān)的常染色體顯性遺傳疾病被歸結(jié)為四類：常染色體顯性遺傳1型穿通腦，腦小血管病伴腦出血[15-16]，腦小血管病伴Axenfeld-Rieger畸形伴遺傳性血管病腎病，遺傳性血管病、腎病、動(dòng)脈瘤和肌肉痙攣綜合征（Hereditary angiopathy with nephropathy，aneurysm and cramps，HANAC）。同一染色體位點(diǎn)上COL4A2基因突變可導(dǎo)致相似的包含腦血管病的多系統(tǒng)受累表型：反復(fù)顱內(nèi)出血[17]、早發(fā)孔洞腦畸形、先天性偏癱、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、腎病、肌病。

2.4 膠原4基因與散發(fā)性出血性腦血管病 散發(fā)性出血性腦血管病的發(fā)病年齡相對(duì)較大、致死率高的特點(diǎn)使得家系分析較為困難，密集的基因組水平基因分型工具的發(fā)展可以分析同一祖先的非親緣關(guān)系人群中的個(gè)體基因信息，并可分析不同表型致病基因的遺傳性估計(jì)值[18-20]。隨著分子遺傳學(xué)進(jìn)展及在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用，尤其全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）技術(shù)的應(yīng)用，使得查找出血性腦血管病致病或相關(guān)基因位點(diǎn)成為可能。

3 膠原4基因與腦出血

3.1 人群基因研究 2007年Vahedi等[21]報(bào)道了一例COL4A1基因（G805R）突變導(dǎo)致反復(fù)深部腦出血；2012年一項(xiàng)COL4A2編碼區(qū)及側(cè)翼序列測(cè)序研究，在入組的96例患者中，4例腦出血患者中發(fā)現(xiàn)3個(gè)導(dǎo)致物種間高度保守的氨基酸缺失的SNP：COL4A2E1123G，COL4A2Q1150K，COL4A2A1690T，這3個(gè)SNP未出現(xiàn)在正常對(duì)照組的284例個(gè)體中，其中的2個(gè)SNP可導(dǎo)致COL4A2蛋白滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并活化未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)[22]。另一項(xiàng)COL4A1編碼區(qū)及側(cè)翼序列測(cè)序研究，在入組的96例腦出血患者中（48例可能的淀粉樣血管變性、48例可能的高血壓性腦出血）有兩例攜帶COL4A1的SNP（rs200786329、rs397514624），在體外細(xì)胞功能試驗(yàn)中證實(shí)此2個(gè)SNP可分別導(dǎo)致脯氨酸羥化異常、前膠原蛋白a1穩(wěn)定性下降，繼而使COL4a1分泌量下降，異常a1蛋白胞內(nèi)聚集。

圍產(chǎn)期新生兒出血性腦血管病可以導(dǎo)致孔洞腦畸形，2013年Murray團(tuán)隊(duì)在一位穿通腦患者基因中發(fā)現(xiàn)COL4A2基因第28個(gè)外顯子中一堿基的變異，導(dǎo)致成膠原結(jié)構(gòu)域的其中一個(gè)甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼幔⑶一颊呶椿疾〉母赣H也具有這一變異。通過對(duì)患者家系成員的皮膚活檢，證實(shí)這一變異可激活未折疊蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致異常折疊的4型膠原在胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集，促進(jìn)蛋白酶體對(duì)未折疊4型膠原的降解，導(dǎo)致基底膜缺陷。苯基丁酸（phenylbutyric acid，PBA）作為化學(xué)分子伴侶可促進(jìn)蛋白折疊，在患者的成纖維細(xì)胞中，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體積減小，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低了患者細(xì)胞凋亡比例。因此提出分子伴侶可作為出血性腦血管病、孔洞腦畸形的一種干預(yù)措施[23]。

一項(xiàng)腦小血管病先證者的家系研究發(fā)現(xiàn)，先證者家族中一腦小血管病患者口服抗凝藥后因癥狀性顱內(nèi)出血去世，此家系患病的6個(gè)成員中均發(fā)現(xiàn)COL4A1基因的第25個(gè)外顯子中G1769A變異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由甘氨酸轉(zhuǎn)換為谷氨酸，導(dǎo)致膠原4a1蛋白結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，使基底膜不穩(wěn)定，故考慮具有COL4A1基因變異者對(duì)抗凝治療或具有更高的顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)[24]。

考慮到一些罕見家族遺傳性單基因病的致病基因可能包含與散發(fā)性常見形式腦血管病相關(guān)的變異，一項(xiàng)納入15個(gè)腦血管病隊(duì)列研究的歐洲祖先人群系統(tǒng)評(píng)價(jià)研究中，包含3個(gè)隊(duì)列組成1545例腦出血患者（分為深部或腦葉出血），其分析結(jié)果也驗(yàn)證了這一假設(shè)，發(fā)現(xiàn)膠原4合成基因COL4A1/COL4A2的3個(gè)SNP與散發(fā)性深部腦出血相關(guān)：rs9521732、rs9521733、rs9515199[25]。這3個(gè)位于COL4A2內(nèi)含子區(qū)域的常見變異（MAF介于0.05～0.5）與深部腦出血這一表型顯著相關(guān)，且相互之間具有高度連鎖不平衡性，數(shù)據(jù)分析顯示此3個(gè)SNP與其他腦血管病表型無顯著相關(guān)，與已知的COL4A2外顯子區(qū)的腦出血相關(guān)SNP（rs117412802、rs62621875、A1690T）之間無緊密連鎖不平衡。

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 上述提到的2006年一項(xiàng)對(duì)腦小血管病家族的測(cè)序研究后續(xù)進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)COL4A1+/Δex40小鼠均出現(xiàn)腦出血，其中50%出生當(dāng)日即死亡，此種成年鼠傾向于出現(xiàn)自發(fā)多灶性腦出血，在觀察到的23個(gè)腦出血病灶中22個(gè)位于基底節(jié)區(qū)（深部），1個(gè)位于腦葉。故考慮COL4A1+/Δex40小鼠具有發(fā)生深部腦出血的傾向[26]。

2012年的96例腦出血患者測(cè)序研究的后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)培養(yǎng)的COL4A2+/G646D、COL4A1+/Δex40小鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，發(fā)現(xiàn)COL4a1/COL4a2的分泌量減少，而胞內(nèi)聚集增多，并且驗(yàn)證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膠原蛋白滯留先于膠原蛋白的胞外／胞內(nèi)比例的上升[21]，導(dǎo)致細(xì)胞毒性反應(yīng)，得出COL4A1和COL4A2基因突變共同具有導(dǎo)致散發(fā)性腦出血的作用的結(jié)論。

2015年一項(xiàng)COL4A1變異小鼠實(shí)驗(yàn)，再次證實(shí)細(xì)胞內(nèi)異常膠原蛋白聚集與腦出血有關(guān)，并且在腦出血發(fā)生的特定時(shí)間窗內(nèi)，給予4-PBA這一外源性分子伴侶促進(jìn)蛋白折疊，可以有效減小腦出血的嚴(yán)重程度，改善預(yù)后[26]。并提出具有膠原4基因變異者在體育運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、缺血性腦血管事件后抗栓藥物選擇方面，應(yīng)更謹(jǐn)慎地權(quán)衡抗栓與出血風(fēng)險(xiǎn)之間的利弊關(guān)系。

4 膠原4基因與蛛網(wǎng)膜下腔出血

一項(xiàng)以雄性遠(yuǎn)交蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠為模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)膜穿刺手術(shù)法制備蛛網(wǎng)膜下腔出血實(shí)驗(yàn)組后，利用蛋白電泳及圖像分析定量，分析蛛網(wǎng)膜下腔出血后不同時(shí)間點(diǎn)出血同側(cè)皮層COL4、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的分布、含量，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在蛛網(wǎng)膜下腔出血后24～72 h內(nèi)，隨著基底膜逐漸破壞，血腦屏障通透性增大，造成顱內(nèi)壓升高和血管神經(jīng)源性水腫，導(dǎo)致功能預(yù)后的下降及死亡等終點(diǎn)事件[27]。

兩項(xiàng)荷蘭人群研究發(fā)現(xiàn)4型膠原基因（COL4A1）的變異與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)[28-31]。而在日本人群中，上述研究中COL4A1的相關(guān)變異與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤未見到相關(guān)性[31]。

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤標(biāo)本病理研究可觀察到基底膜成分的碎片，例如4型膠原和纖連蛋白[32]，有觀點(diǎn)認(rèn)為可能由硫酸乙酰肝素糖蛋白-2與其他成分失去關(guān)聯(lián)所致。另一方面，4型膠原碎片的出現(xiàn)也可能由COL4A1變異導(dǎo)致，并且這種變異導(dǎo)致了動(dòng)脈瘤的破裂[28]。

5 膠原4基因與出血轉(zhuǎn)化

缺血性腦血管病是因血管病變導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的過程，近年來，缺血性卒中腦損害過程中的血管損害受到關(guān)注。腦微循環(huán)系統(tǒng)的小血管均包含3層結(jié)構(gòu)：血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜、星形細(xì)胞末足。內(nèi)皮細(xì)胞和星形細(xì)胞末足連接基底膜。發(fā)生缺血性腦血管病時(shí)，基膜的破壞、拆解使內(nèi)皮細(xì)胞和星形細(xì)胞末足與基底膜失去連接，最終導(dǎo)致小血管通透性增加，出血轉(zhuǎn)化，腦組織水腫和微循環(huán)功能障礙[33]。

在一項(xiàng)納入28項(xiàng)觀察性研究和19項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的缺血性卒中出血轉(zhuǎn)化研究中，發(fā)現(xiàn)隨著抗血小板及溶栓藥物使用的增加，出血轉(zhuǎn)化的發(fā)生率明顯上升。而在未使用抗血小板藥或溶栓治療的患者中，幾乎不會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的出血轉(zhuǎn)化，發(fā)生率僅為8.5%，癥狀性顱內(nèi)出血發(fā)生率僅1.5%[34]。

一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）除溶栓作用外，也是神經(jīng)血管單元的重要信號(hào)因子和細(xì)胞外蛋白酶。tPA介導(dǎo)腦發(fā)育過程中細(xì)胞基質(zhì)的重塑，干預(yù)其可塑性，可通過與NMDA型谷氨酸受體相互作用而增大潛在的細(xì)胞毒性鈣超載。在特定濃度下，tPA可以定向作用于血管，最終通過增加卒中后MMP的調(diào)節(jié)異常而破壞細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，增加血管源性細(xì)胞死亡，血腦屏障滲漏、水腫、出血轉(zhuǎn)化[35]。

4型膠原作為血腦屏障中基底膜的重要成分，在各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的免疫標(biāo)記中被作為基底膜破壞程度、血腦屏障滲漏程度的指標(biāo)。具有COL4基因變異的患者是否對(duì)抗血小板、溶栓治療具有更高不穩(wěn)定性，更傾向于出血轉(zhuǎn)化；在缺血性腦血管病后一系列局部腦組織病理變化通路中，基底膜完整性是否較無變異者更易于受到藥物、信號(hào)因子等繼發(fā)因素影響，有待進(jìn)一步探究。

6 總結(jié)

基底膜是血腦屏障的重要組成部分，對(duì)細(xì)胞起結(jié)構(gòu)支持和動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為與微環(huán)境關(guān)系的作用。4型膠原是基底膜最為重要的組成部分。COL4A1/A2基因的變異已證實(shí)與包括反復(fù)腦出血、深部腦出血表型的單基因遺傳綜合征相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同的COL4A1/A2基因變異可導(dǎo)致異常折疊的COL4a1、a2蛋白沉積于胞內(nèi)，導(dǎo)致基底膜穩(wěn)定性及調(diào)節(jié)功能降低，可以導(dǎo)致腦出血、梗死后出血轉(zhuǎn)化、腦出血血腫擴(kuò)大和腦水腫等，引起預(yù)后不良及死亡率增加。人群基因研究發(fā)現(xiàn)在散發(fā)性出血性腦血管病患者可存在COL4A1/A2基因變異。不同遺傳背景人群的基因頻率、外顯率存在差異，進(jìn)一步開展在不同遺傳背景下散發(fā)性出血性腦血管病的人群中COL4A1/A2變異篩查，對(duì)于理解出血性腦血管病發(fā)病機(jī)制，早期干預(yù)高危人群（例如增加膠原蛋白折疊的外源分子伴侶），尋找新的更具針對(duì)性的治療方法有重要意義。同時(shí)，缺血性腦血管病人群中服用抗血小板聚集藥物，抗凝藥物等抗栓治療，或是接受溶栓治療患者，均存在潛在出血風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于既往不明原因腦出血、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、一級(jí)親屬中腦出血病史者，進(jìn)行高?；颍鏑OL4A1/A2基因變異的篩查，對(duì)于指導(dǎo)二級(jí)預(yù)防和急性期治療可能有一定參考意義。

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