痰與其他下呼吸道標(biāo)本的細(xì)菌學(xué)檢查的探討

熊淑芹 孫 靜 李秋苓

（山東省平陰縣疾病預(yù)防控制中心 山東 平陰 250400）

痰培養(yǎng)主要針對下呼吸道感染病原菌的調(diào)查，如細(xì)菌性肺炎肺結(jié)核、慢性吃氣管炎、支氣管擴(kuò)張癥、肺膿腫、深部霉菌性肺部感染或肺炎支原體引起的感染等。

如分離到結(jié)核分枝桿菌、肺炎支原體或深部霉菌，則可確定為該菌與感染有關(guān)，如如分離到金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌等則要小心判斷，因?yàn)樗麄円嗫赡苁巧虾粑莱Ｔ诰?。?xì)菌性肺炎可能分離到的細(xì)菌菌種有：金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌科細(xì)菌；肺結(jié)核可能分離到的細(xì)菌：結(jié)核分枝桿菌、鳥—胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分支桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌。

1 標(biāo)本采集

1.1 采集標(biāo)本均應(yīng)在用藥前，一般以晨痰為好，刷牙，漱口，以除去口腔內(nèi)大部分雜菌，患者用力自肺部深處咳出的分泌物，吐入無菌容器內(nèi)，一小時內(nèi)送檢。

1.2 檢查結(jié)核分枝桿菌者，清晨采集得當(dāng)。如患者咳痰較少，則應(yīng)采集24小時痰液，結(jié)核培養(yǎng)者應(yīng)連續(xù)三天采集三次晨痰。

1.3 痰培養(yǎng)亦可用氣管穿刺抽取標(biāo)本，用14號針頭經(jīng)環(huán)狀與甲狀軟骨膜小心穿刺。

1.4 支氣管分泌物，應(yīng)有專科醫(yī)師用支氣管鏡雙層套刷直接采集肺部的感染物。雙層導(dǎo)管可保護(hù)采集刷不受口腔正常菌的污染，細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)法評價標(biāo)本的細(xì)菌量，一般以103CFU／ml為臨界值。菌落計(jì)數(shù)方法：取標(biāo)本約0.1 ml直接插入1.0 ml無菌的林格乳酸鹽溶液，再用接種環(huán)取約0.01 ml置培養(yǎng)基，CO2環(huán)境培養(yǎng)過夜后作細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)。當(dāng)平板上生長菌落大于10個時，表示培養(yǎng)陽性有意義。

1.5 支氣管肺胞沖洗液采集方法，亦用支氣管鏡雙層套刷。須灌入生理鹽水，使之達(dá)到支氣管、肺泡、再收回，重復(fù)數(shù)次。目的是將肺泡內(nèi)分泌物洗出來，標(biāo)本應(yīng)用同時作涂片檢查，鱗狀上皮細(xì)泡數(shù)目≤1%時，表示未受到口腔分泌物污染。菌落計(jì)數(shù)≥105CFU／ml才具有診斷意義。此法診斷細(xì)菌性肺炎的敏感度達(dá)100%、特異性亦達(dá)100%。厭氧培養(yǎng)，診斷厭氧菌引起的肺膿瘍。

2 肉眼觀察

觀察痰液的顏?zhàn)?、粘度、有無血絲、濃，如痰呈水樣，明顯是唾液，應(yīng)拒收。如有顆粒存在，則應(yīng)注意可能與放線菌及奴卡菌屬有關(guān)。

3 革蘭氏染色圖片檢查

選擇呈血色或銹色的膿樣標(biāo)本作涂片革蘭氏染色鏡檢。

3.1 如診斷為肺炎或標(biāo)本來自重癥監(jiān)護(hù)病房，應(yīng)在2小時內(nèi)作出圖片的初步報告。

3.2 一般病人的標(biāo)本可在當(dāng)日作出初步報告。

3.3 涂片觀察應(yīng)細(xì)菌的染色、形態(tài)、排列，以及真菌或霉菌的狍子或菌絲。

3.3.1 如發(fā)現(xiàn)許多具有莢膜、矛頭狀排列的革蘭氏陽性雙球菌（有時呈單個、短鏈狀），可能是肺炎鏈球菌，作再作莢膜染色或莢膜腫脹反應(yīng)。

3.3.2 如發(fā)現(xiàn)許多革蘭氏陽性球菌成簇狀排列，可能是金黃色葡萄球菌。

3.3.3 如發(fā)現(xiàn)許多短而粗的、具有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，可能是肺炎克雷伯球菌。

3.3.4 如發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性分枝桿菌，應(yīng)懷疑為放線菌或奴卡菌，如肉眼見到硫磺顆粒，則可能性更大，應(yīng)作抗酸染色，并接種專用培養(yǎng)基。

3.3.5 如發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性的酵母菌或其他霉菌，應(yīng)接種培養(yǎng)基進(jìn)行分離。

3.4 革蘭氏染色涂片的結(jié)果僅為假設(shè)性診斷，快速做出初步報告，并以培養(yǎng)方法證實(shí)。

3.5 痰標(biāo)本接種前還應(yīng)作白細(xì)胞和上皮細(xì)胞的檢查，用革蘭氏染色涂片以低倍鏡觀察并計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞及鱗狀上皮細(xì)胞，當(dāng)鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)＞＜25／LPF時應(yīng)重新送標(biāo)本。

4 痰標(biāo)本接種處理

4.1 漂洗法將膿樣痰倒入盛有生理鹽水及玻璃珠的試管中，充分振搖，然后用接種壞接種標(biāo)本。

4.2 痰溶劑處理法

4.3 消化—去污處理法

5 接種

5.1 按《微生物學(xué)手冊》要求接種相應(yīng)的培養(yǎng)基

5.2 常規(guī)的痰培養(yǎng)基

5.2.1 一個雙盤平板：一半是苯乙醇瓊脂（內(nèi)含粘菌素和萘啶酸），另一半是EMB或MAC瓊脂。

5.2.2 一個血平板：并貼0.04單位的桿菌肽紙片，如懷疑肺炎球菌時，可再貼5ug／片奧本托欣紙片。

5.2.3 一個巧克力平板。

5.2.4 每個平板均按分段劃線法，將標(biāo)本中的細(xì)菌分離出來。5.2.5 孵育在35℃5%CO2環(huán)境中。

6 鑒定及報告

6.1 第二天觀察各種平板，并記錄細(xì)菌生長的數(shù)量及菌落形態(tài)。

6.2 每一種生長菌以多量、中量、少量和極少量表示之。（第一區(qū)＞10個，第二區(qū)＜5個為少量；第一區(qū)＞10個，第二區(qū)＞5個為中量；第一區(qū)＞10個，第二區(qū)＞5個，第三區(qū)＞5個為多量）。

6.3 作涂片革蘭氏染色鏡檢。

6.4 具有金黃色葡萄球菌、腸桿菌科細(xì)菌、或綠膿假單胞細(xì)菌等快速生長菌，可立即做快速藥敏實(shí)驗(yàn)。

6.5 按需要做生化試驗(yàn)，亦鑒定細(xì)菌。

6.6 有可能的話第二天就可發(fā)出最后報告。如疑金黃色葡萄球菌—做血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，如疑銅綠假單跑菌—氧化酶實(shí)驗(yàn)，如疑大腸埃希氏菌—靛基質(zhì)試驗(yàn)，肺炎鏈球菌—膽汁溶菌、奧本托欣實(shí)驗(yàn)。

6.7 第三天可報告常規(guī)痰培養(yǎng)的結(jié)果 寫出菌名并標(biāo)出生長的菌量、以數(shù)量多寡排列。例如：主要生長菌為 金黃色葡萄球菌，多量；流感嗜血桿菌，多量；奈瑟菌屬細(xì)菌，少量。報告多量生長菌的藥敏結(jié)果。

6.8 只有當(dāng)培養(yǎng)生長菌數(shù)量為多量時到中量時才有可能為致病菌。

6.9 痰培養(yǎng)可能有1～3種報告，臨床醫(yī)師可依據(jù)臨床癥狀及涂片結(jié)果判斷作出何種為真正的致病菌。例如肺炎鏈球菌生長速度較慢，可能被生長速度快的細(xì)菌所掩蓋，培養(yǎng)結(jié)果僅供參考，很可能被忽略掉，如先觀看直接涂片，可以反映標(biāo)本中各種細(xì)菌的真實(shí)數(shù)量。

7 注意事項(xiàng)

痰培養(yǎng)經(jīng)常會有錯誤發(fā)生、至少能得到很準(zhǔn)確的結(jié)果，其原因有：

7.1 收集標(biāo)本的人員不明了必須采集新鮮、深部咳出的痰液。

7.2 沒有迅速將標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室，檢驗(yàn)人員沒有立即處理標(biāo)本。

7.3 痰標(biāo)本受到口咽處正常菌群的污染。

7.4 難以決定所分離到的菌種何者確實(shí)與肺部感染有關(guān)，因痰培養(yǎng)很少得到純培養(yǎng)。曾經(jīng)有人報告肺炎鏈球菌菌血癥的患者痰標(biāo)本中有45%培養(yǎng)不出現(xiàn)肺炎鏈球菌。

7.5 痰標(biāo)本不能作厭氧培養(yǎng)。

7.6 痰液標(biāo)本作結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 作結(jié)核分枝桿菌檢查的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備生物安全柜，操作室的消毒設(shè)施必須安全，沾有分枝桿菌的接種環(huán)不能直接在火焰上消毒，任何廢棄物必須滅菌后棄之，任何時候應(yīng)防止感染自己或傳染他人。