良性膽管狹窄形成機(jī)制的研究進(jìn)展

黃峻松綜述，李光早審校

良性膽管狹窄是指各種非腫瘤性因素導(dǎo)致膽管纖維組織增生、瘢痕攣縮，形成的膽管纖維性狹窄。狹窄部位可發(fā)生于肝內(nèi)及肝外膽管，可單發(fā)亦可多發(fā)。目前針對良性膽管狹窄所采取的手術(shù)修復(fù)，效果較差，術(shù)后再狹窄發(fā)生率高［1］，近年來，隨著基因與分子生物學(xué)等的發(fā)展，一些基因表達(dá)產(chǎn)物及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在瘢痕組織所起的作用不斷被揭示，進(jìn)而應(yīng)用到良性膽管狹窄中?，F(xiàn)就良性膽管狹窄形成機(jī)制的進(jìn)展作一綜述。

1 肌成纖維細(xì)胞

傷口的愈合均伴隨著瘢痕的形成，沒有瘢痕傷口就不能愈合，瘢痕是傷口愈合必然經(jīng)歷的一個過程［2］。瘢痕部位膠原的過量沉積導(dǎo)致瘢痕過度增生［3］。膽道瘢痕性攣縮和管腔狹窄是良性膽管狹窄突出表現(xiàn)。馬曉等［4］通過制作家兔膽總管損傷修復(fù)模型，發(fā)現(xiàn)膽管愈合方式屬于過度愈合，愈合時間延長，膽管黏膜上皮修復(fù)較差，慢性炎癥持續(xù)存在，成纖維細(xì)胞增生活躍，愈合后黏膜下膠原纖維過度沉積，改建較差，結(jié)果導(dǎo)致瘢痕增生，吻合口狹窄發(fā)生率較高。近年來，人們逐漸認(rèn)識到肌成纖維細(xì)胞(MFB)與瘢痕攣縮關(guān)系密切［5］，其特征介于平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間。正常情況下，MFB 通過細(xì)胞凋亡而死亡、消失，而在增生性瘢痕和纖維化疾病中持續(xù)存在［6］。有研究表明巨噬細(xì)胞及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)的高表達(dá)與膽道瘢痕增生有密切關(guān)系［7］。其原因可能與管壁慢性炎癥有關(guān)。炎性反應(yīng)持續(xù)存在造成上皮愈合后巨噬細(xì)胞仍大量聚集，持續(xù)合成、分泌多肽生長因子，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖旺盛，膠原過度合成，管腔瘢痕性狹窄。耿智敏等［8］在制作犬肝外膽管損傷修復(fù)模型中觀察到膽管瘢痕組織存在大量肌成纖維細(xì)胞。細(xì)胞功能活躍，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體，靠近細(xì)胞膜處有發(fā)育良好的微絲和密體，核卷曲不規(guī)則，從而提供了細(xì)胞收縮的證據(jù)。MFB 術(shù)后1 周時開始出現(xiàn)，3 個月時達(dá)到高峰，高峰期持續(xù)較長一段時間。細(xì)胞的生活周期與肉芽組織的增生收縮過程基本一致。

2 血小板衍化生長因子

血小板衍化生長因子(PDGF)是一種與損傷修復(fù)有關(guān)的生長因子，在損傷修復(fù)中可以不同的方式產(chǎn)生。PDGF 生物學(xué)特性包括:①促分裂效應(yīng)，PDGF 刺激血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的分裂增生;②趨化活性，對中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞有趨化性;③參與細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)化過程的調(diào)控。PDGF 對成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等有趨化作用，并刺激成纖維細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其合成膠原、纖維連接蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)等成分，以形成肉芽組織，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。創(chuàng)傷后釋放的PDGF 是單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(FB)的黏附趨化劑，并促進(jìn)其增殖，激活巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)FB 產(chǎn)生膠原蛋白和纖維連接蛋白，并使膠原酶活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的更新。FB 在過度增生炎性組織中的化學(xué)趨化和促進(jìn)有絲分裂的反應(yīng)明顯高于炎性組織，可能與細(xì)胞表面PDGF 受體水平不同有關(guān)。Ladin 等［9］在病理性瘢痕組織里培養(yǎng)FB，PDGF 蛋白的表達(dá)升高。創(chuàng)傷后釋放的PDGF 是單核細(xì)胞和FB 的黏附趨化劑，并促進(jìn)其增殖，激活巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)FB 產(chǎn)生膠原蛋白和纖維連接蛋白，并使膠原酶活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的更新。PDGF 表達(dá)與多種生長因子在調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)方面有相互影響的作用，它們相互協(xié)調(diào)控制，共同作用影響組織的修復(fù)增生［10-11］。陳衛(wèi)明等［12］研究表明，PDGF 在肝內(nèi)、外膽管瘢痕組織的膽管上皮細(xì)胞、增生的FB、血管內(nèi)皮細(xì)胞及一些炎癥細(xì)胞中均有強(qiáng)陽性表達(dá)。主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。正常膽管組表達(dá)較弱，甚至無表達(dá)。說明PDGF 與膽管瘢痕形成有著密切的關(guān)系。

3 結(jié)締組織生長因子

結(jié)締組織生長因子(CTGF)是富含半胱氨酸的分泌型肝磷脂結(jié)合蛋白［13］，屬即刻早反應(yīng)基因(CCN)家族一員，它是一種新發(fā)現(xiàn)的促成纖維細(xì)胞分裂和膠原沉積的生長因子。正常情況下，結(jié)締組織生長因子信使核糖核酸(CTGF mRNA)在心臟、肺、胎盤、肝、肌肉及腎臟等臟器中均有表達(dá)，其生物效應(yīng)包括促進(jìn)細(xì)胞肥大、黏附、增生、分化、遷移、血管形成和凋亡，參與胚胎發(fā)育、胎盤形成、腫瘤形成等。在機(jī)體損傷和纖維化時，CTGF 高表達(dá)并作為TGF-β1的下游元件，介導(dǎo)TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子、脂質(zhì)過氧化物等多種信號刺激的促纖維化作用，促進(jìn)包括肝星狀細(xì)胞(HSC)在內(nèi)的多種纖維活性細(xì)胞因子合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)［14-15］，而TGF-β1對CTGF 的產(chǎn)生有明顯調(diào)控作用。體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞與正常皮膚的相比較，膠原合成、CTGF 及CTGF 基因表達(dá)均顯著增高。這些均表明在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕纖維化進(jìn)程中CTGF 發(fā)揮了重要作用，隨著CTGF DNA 向CTGF mRNA 的高水平轉(zhuǎn)錄，大量的CTGF 蛋白被合成，從而刺激成纖維細(xì)胞的增殖及膠原沉積，通過自分泌、旁分泌作用，增殖的成纖維細(xì)胞又會產(chǎn)生更多的CTGF，形成正向反饋，最終形成大量纖維組織。目前的研究認(rèn)為，CTGF 的致纖維化作用可能是依賴Ras/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶活化激酶(MEK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)和Smad 信號途徑介導(dǎo)的［16］。最近研究發(fā)現(xiàn)CTGF與膽管纖維化程度呈正相關(guān)，耿智敏等［17］對23 例良性膽管狹窄的病例進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CTGF、CTGF mRNA 在良性狹窄膽管組織中的陽性率分別為82.6%和65.2%;而在正常膽管組織中的陽性率分別為50.0%和16.7%，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。既往的研究發(fā)現(xiàn)，人良性狹窄膽管組織中可檢測到TGF-β1及其受體高表達(dá)于肉芽組織、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，說明CTGF 作為TGF-β1的下游效應(yīng)遞質(zhì)，在術(shù)后狹窄膽管組織中呈高表達(dá)，介導(dǎo)TGF-β1的致纖維化生物學(xué)作用。這提示在膽管組織瘢痕增生、良性狹窄形成過程中，被激活的成纖維細(xì)胞和增殖的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，進(jìn)一步生成更多的CTGF，繼而刺激成纖維細(xì)胞合成膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)，抑制膠原蛋白分解，增加新生小血管，誘導(dǎo)創(chuàng)傷修復(fù)。TGF-β1和CTGF 的高表達(dá)，擾亂了膠原合成與降解的平衡，刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原及其基質(zhì)成分并沉積，導(dǎo)致瘢痕增生，最終導(dǎo)致膽管狹窄形成。

4 IL-6/gp130/STAT3 傳導(dǎo)通路

白介素-6(IL-6)/糖蛋白130(gp130)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)是具有多重生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，它在不同的組織及細(xì)胞中發(fā)揮著不同的作用。IL-6 通過受體作用于細(xì)胞表面IL-6 受體(IL-6R)，該受體含有兩個亞基:IL-6Rα和IL-6Rβ，二者均是Ⅱ型膜糖蛋白分子。IL-6 與IL-6Rα 結(jié)合后識別gp130，形成由兩分子IL-6、兩分子IL-6Rα、兩分子gp130 構(gòu)成的六聚體，該六聚體可激活胞漿區(qū)Janus 激酶2(JaK2)酪蛋白激酶，后者通過誘導(dǎo)STAT3 的酪氨酸殘基磷酸化而激活STAT3，并與STAT1 蛋白或另一個STAT3 蛋白的Src 同源結(jié)構(gòu)域2(SH2)功能區(qū)識別并結(jié)合，形成穩(wěn)定的同源或異源二聚體，暴露它的核定位區(qū)，易位到核內(nèi)，結(jié)合到不同靶基因的啟動子區(qū)而啟動轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的活化、增殖、分化、存活、凋亡抑制及惡性轉(zhuǎn)化［18］。正常的膽管上皮細(xì)胞內(nèi)通常不表達(dá)或低表達(dá)白介素-6 信使核糖核酸(IL-6 mRNA)，但膽管損傷后(如感染、膽管梗阻、膽汁淤積及免疫損傷等)可以促進(jìn)增殖的膽管上皮細(xì)胞和其周圍的淋巴細(xì)胞釋放IL-6 mRNA 及蛋白［19］，因而改變膽管上皮細(xì)胞的微環(huán)境，從而在損傷的膽管上皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生IL-6/STAT3 信號通路的自分泌、旁分泌作用，致使該通路持續(xù)活化。此外，非新生的膽管上皮細(xì)胞在其他炎癥因子作用下，如IL-1β、TNF2α，也能合成IL-6，成為膽管上皮細(xì)胞在應(yīng)激或損傷狀態(tài)下的自分泌生長因子［20］。肝移植術(shù)過程的冷保存-再灌注也是造成膽管上皮細(xì)胞損傷的因素之一，也是引起膽管非吻合口性狹窄的常見原因。Demetris 等［19］通過應(yīng)用免疫印跡及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肝移植術(shù)后肝組織中STAT3 的含量發(fā)現(xiàn)，IL-6+/+的小鼠肝組織中IL-6/gp130/STAT3 信號傳導(dǎo)途徑處于活化狀態(tài)，而IL-6-/-者則處于失活狀態(tài)，說明IL-6/STAT3 作為調(diào)控細(xì)胞增殖的重要信號通路，可能是介導(dǎo)肝移植后膽管上皮細(xì)胞增殖的分子機(jī)制之一。陳莉萍等［21］應(yīng)用免疫組化技術(shù)對200 只小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，肝移植術(shù)后組肝內(nèi)炎癥反應(yīng)強(qiáng)而持久，膽管樹周圍肝組織IL-6 mRNA 含量處于較高水平，STAT3 活化程度及肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞增生情況均顯著高于只進(jìn)行開腹手術(shù)的對照組(P ＜0.05)，這提示膽管損傷后膽管上皮細(xì)胞的增生存在IL-6/gp130 傳導(dǎo)通路的激活，STAT3 的活化可能來自于IL-6 的刺激，且活化程度與IL-6 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。

5 Smad 蛋白

TGF-β1是目前公認(rèn)的與瘢痕形成關(guān)系最密切、最具代表性的生長因子［22］。TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)是通過特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控，其中Smad 是該路徑中的關(guān)鍵蛋白，被稱為TGF-β 信號跨細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要換能器，它是TGF-β1受體后信號分子，參與對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、合成、分泌和凋亡的調(diào)控。根據(jù)Smad 蛋白在TGF-β1轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中結(jié)構(gòu)和功能特點的不同，可分為3 類［23］:①受體激活型Smad，主要有Smad 1、2、3、5、8，它們是TβR 復(fù)合物的下游信號分子，其中Smad 2、3 主要介導(dǎo)TGF-β1和生物素的信號;②共同通路型Smad，是TGF-β1必需的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，目前在哺乳動物發(fā)現(xiàn)的有Smad 4;③抑制性Smad，主要有Smad 6、7，抑制其他兩類Smad 的活性。TGF-β1/Smad 信號傳導(dǎo)通路通過正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路進(jìn)行調(diào)控的，Smad 4/Smad 7 分別是兩個環(huán)路中的重要因子。TGF-β1可通過Ⅰ、Ⅱ型受體、Smad 通路傳遞并放大信號，由磷酸化的Smad 激活核內(nèi)TGF-β1啟動子，誘導(dǎo)內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)，形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路;同時，磷酸化的Smad 激活抑制性因子Smad 7 的啟動子，瞬時上調(diào)Smad 7 表達(dá);磷酸化的Smad 2 和磷酸化的Smad 3 還作用于自身的基因啟動子區(qū)抑制基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)細(xì)胞中受體調(diào)節(jié)型Smad(R-Smad)的水平，抑制自身的信號傳遞。于是，TGF-β1通過激活Smad 7 和下調(diào)R-Smad的表達(dá)形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路從而抑制自身的信號傳導(dǎo)。耿智敏等［24］應(yīng)用免疫組化等方法對23 例良性膽管狹窄的研究顯示，Smad 4 在良性膽管狹窄組織中陽性率為78.3%，而在正常膽管組織中為33.3%，在狹窄膽管組的陽性率明顯高于正常膽管組(P ＜0.05)。此實驗說明Smad 蛋白與良性膽管狹窄形成有著密切關(guān)系，TGF-β1水平增高通過正反饋途徑增強(qiáng)自身及受體的表達(dá)，使生物活性放大，引起Smad 4 高表達(dá)，同時上調(diào)的Smad 7 發(fā)揮不了有效的拮抗作用，使成纖維細(xì)胞活躍，擾亂了膠原合成與降解平衡，大量的膠原及其基質(zhì)成分沉積，導(dǎo)致瘢痕增生，最終狹窄形成。

6 原癌基因蛋白C-MYC 和C-FOS

早期基因C-MYC 和直接早期基因C-FOS 均屬于核內(nèi)結(jié)合蛋白類癌基因，是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的終端，它們的產(chǎn)物核蛋白(C-MYC、C-FOS)主要分布于基底層細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等功能活躍的細(xì)胞，對調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平及介導(dǎo)細(xì)胞由靜止期向增殖期轉(zhuǎn)化并在傷口愈合中起重要作用。C-MYC與C-FOS 在增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞中可被持續(xù)存在的較高水平的TGF-β1所激活，C-MYC 原癌基因活化后，可以促進(jìn)細(xì)胞由靜止期(G0 期)進(jìn)入分裂期(S 期)，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖。C-MYC 原癌基因表達(dá)的蛋白定位于核內(nèi)，與某些癌基因協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，最終使細(xì)胞進(jìn)入S 期。C-MYC 基因參與了此過程并起重要作用，尤其是細(xì)胞從G0 期進(jìn)入G1 期的過程。C-MYC 原癌基因表達(dá)是細(xì)胞有絲分裂的中介物，它可與多種生長因子在調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)方面相互影響，相互協(xié)調(diào)，共同作用影響組織的修復(fù)增生［25-26］。C-FOS 基因在成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、造血細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖和分化中起重要的作用。在正常的膽管組織中，C-FOS 基因僅呈極低水平表達(dá)，但在膽管組織的炎癥、局部低氧及膽汁中的膽鹽、卵磷脂或返流的腸液等各種因素的刺激下，C-FOS 能迅速表達(dá)，其編碼的細(xì)胞核磷酸蛋白具有DNA 結(jié)合活性，被看做是細(xì)胞核內(nèi)的“第三信使”。C-FOS 能使細(xì)胞由G0 期啟動而進(jìn)入細(xì)胞周期。在細(xì)胞周期中，細(xì)胞周期蛋白與相應(yīng)的細(xì)胞周期依賴蛋白激酶結(jié)合，經(jīng)磷酸化/脫磷酸化修飾后具有活性，促使與周期有關(guān)的蛋白基因表達(dá)，從而控制細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)膽管組織中成纖維細(xì)胞等的增殖與合成。此外C-MYC 與C-FOS 蛋白表達(dá)的細(xì)胞定位、陽性信號形態(tài)及強(qiáng)度較為相似，說明兩者在促進(jìn)瘢痕形成的過程中具有相互協(xié)同的作用，參與了成纖維細(xì)胞的增殖和功能調(diào)控以及膠原合成與降解，從而導(dǎo)致異常瘢痕的增生。張小文等［27］應(yīng)用免疫組織化學(xué)等方法對12 例肝內(nèi)膽管狹窄及8 例肝外膽管狹窄組織中C-MYC、C-FOS 基因表達(dá)程度的研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)、外膽管瘢痕組織中C-MYC、C-FOS 基因表達(dá)均較高，而在正常膽管組織表達(dá)較弱，甚至無表達(dá)，經(jīng)兩兩比較，肝內(nèi)、外膽管瘢痕組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，而兩組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，說明原癌基因C-MYC 和CFOS 與膽管瘢痕形成有密切的關(guān)系。

7 人類細(xì)胞同源Fas 相關(guān)死亡域樣白介素1β 轉(zhuǎn)化酶樣抑制蛋白

Fas 相關(guān)死亡域樣白介素1β 轉(zhuǎn)化酶(FLICE)樣抑制蛋白(c-FLIP)是表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中的重要的抗凋亡蛋白之一［28］，其串聯(lián)結(jié)構(gòu)中含有兩個死亡效應(yīng)域，可通過競爭性結(jié)合某些凋亡受體的死亡域結(jié)構(gòu)如Fas 相關(guān)死亡域(FADD)和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，導(dǎo)致天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)前體激活受阻，從而引起凋亡失敗。目前所知的FLIP 家族包括病毒FLIP(v-FLIP)和細(xì)胞內(nèi)FLIP(c-FLIP)。后者包括長鏈c-FLIP(c-FLIPL)、短鏈c-FLIP(c-FLIPS)和c-FLIPR 等3 種蛋白表達(dá)。其中，c-FLIPL 的氨基酸碳末端含有兩個串聯(lián)的死亡效應(yīng)域(DED)，其后連接有一個類caspase 域。兩個DED 可使FLIP 偶聯(lián)調(diào)節(jié)分子FADD 或者caspase-8、caspase-10 前體，從而阻斷凋亡［29］。何貴金等［30］通過多聚寡核苷酸原位探針雜交的檢測方法發(fā)現(xiàn)，c-FLIP 基因mRNA 在膽管損傷修復(fù)的各個時間段均呈明顯陽性表達(dá)，主要定位于成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，而假手術(shù)組很少表達(dá)。說明膽管愈合實際是一個正常凋亡受抑制的過程，以纖維修復(fù)為主，而炎性細(xì)胞的表達(dá)或許與膽管環(huán)境下的慢性炎癥刺激有關(guān)。同時也發(fā)現(xiàn)，c-FLIP 在淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以血管內(nèi)皮細(xì)胞中有程度不等的表達(dá)。這些炎癥免疫細(xì)胞將直接參與炎癥過程并不斷釋放大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，c-FLIP 的表達(dá)將造成這些炎癥細(xì)胞的凋亡減少，增殖加速，進(jìn)而釋放更多炎癥因子促進(jìn)炎癥的持續(xù)進(jìn)行，于是反過來又將持續(xù)性激活c-FLIP 上游核因子kappa B(NFκB)引起更多的c-FLIP 表達(dá)，這是一個正反饋的過程，或許也是造成膽管成纖維細(xì)胞大量增殖的原因之一。

綜上所述，良性膽管狹窄的形成是一個極其復(fù)雜的過程，可能涉及多種基因表達(dá)產(chǎn)物和多種信號傳導(dǎo)途徑因素的參與，而這些因素之間可能存在交叉交互作用。目前對良性膽管狹窄形成機(jī)制只是初步了解，暫沒有一個整體觀念。要真正闡明其發(fā)病機(jī)制及發(fā)展過程，進(jìn)而為膽管狹窄的早期診斷及有效防治提供理論依據(jù)，需要基礎(chǔ)和臨床工作者做更多的工作。

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