胃食管反流病相關(guān)的細(xì)胞間隙增寬和緊密連接蛋白*

譚佳成 葉必星 林 琳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)系指胃內(nèi)容物反流入食管，引起不適癥狀和(或)并發(fā)癥的一種疾病。GERD分為糜爛性食管炎(erosive esophagitis，EE)、非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)和Barrett食管(Barrett’s esophagus，BE)。抗反流屏障功能障礙在GERD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，包括下食管括約肌松弛、食管反流物清除障礙、食管黏膜防御能力下降等［1］。其中食管黏膜防御功能主要由上皮屏障完成，包括上皮細(xì)胞膜和緊密連接(tight junction，TJ)。有研究發(fā)現(xiàn)，GERD患者食管上皮TJ蛋白表達(dá)和分布異常可導(dǎo)致上皮細(xì)胞間隙增寬(dilated intercellular spaces，DIS)，可能成為GERD食管形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的客觀指標(biāo)［2，3］。本文就TJ蛋白、DIS與GERD的關(guān)系作一綜述。

一、TJ組成

TJ是細(xì)胞與細(xì)胞間連接的重要形式，是一系列跨膜蛋白與外周蛋白相互作用形成的復(fù)雜蛋白質(zhì)體系，由多種信號(hào)調(diào)控。TJ是構(gòu)成上皮機(jī)械屏障最重要的結(jié)構(gòu)，由occludin蛋白、claudin蛋白、胞質(zhì)緊密黏連蛋白(zonula occludens，ZOs)、連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)等結(jié)構(gòu)蛋白和各類連接蛋白共同組成［4］。上皮細(xì)胞屏障功能損傷與TJ復(fù)合物的解離或缺失有關(guān)［5］。

Occludin是TJ的重要結(jié)構(gòu)成分，彼此間相互作用，亦可與ZOs發(fā)生聯(lián)系，然后間接與肌動(dòng)蛋白和JAMs相互作用，構(gòu)成上皮完整的 TJ［6］。免疫電鏡顯示，occludin定位于TJ，不僅通過細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域在相鄰細(xì)胞間以“拉鏈”的方式結(jié)合，進(jìn)而嚴(yán)密封閉細(xì)胞旁間隙;還可通過與該區(qū)域其他TJ蛋白結(jié)合，參與 TJ的信號(hào)調(diào)節(jié)［7］。

Claudin在相鄰細(xì)胞間以“拉鏈”狀相互結(jié)合產(chǎn)生細(xì)胞旁封閉。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)24種claudin超家族成員。claudin分子上存在與支架蛋白ZO-1結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，通過ZO-1將自身固定于細(xì)胞骨架，參與細(xì)胞旁通透性的調(diào)節(jié)。目前對(duì)claudin-1的研究較多，其是TJ的主要功能蛋白，對(duì)維持上皮細(xì)胞屏障以及TJ的完整性具有重要作用［8～10］。

ZOs是TJ的支架蛋白，位于細(xì)胞內(nèi)膜表面，與絕大多數(shù)膜TJ蛋白以及細(xì)胞骨架相連。ZOs屬膜相關(guān)鳥苷酸激酶(MAGUK)家族，包括 ZO-1、ZO-2 和 ZO-3 三個(gè)異構(gòu)體［11］，其蛋白結(jié)構(gòu)相似，均含特殊的亮氨酸鋅指樣結(jié)構(gòu)。目前研究較多的是ZO-1，其分子質(zhì)量為225 kDa(1 Da=0.9921 u)，包含3個(gè)PDZ(PSD-95、Dlg和ZO-1)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域、1個(gè)GUK結(jié)構(gòu)域的氨基端和連接到肌動(dòng)蛋白的羧基端［11］。

JAMs是一類Ca2+非依賴性的免疫球蛋白，具有2個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域和1個(gè)含PDZ結(jié)合區(qū)的胞漿結(jié)構(gòu)域以及多個(gè)磷酸化位點(diǎn)［12］。JAMs主要表達(dá)于內(nèi)皮/上皮細(xì)胞的TJ，亦可見于血循環(huán)白細(xì)胞和血小板［13］。JAMs不同的分子含有不同的功能域，借助其在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的不同定位、對(duì)多種配體的不同親和力，發(fā)揮重要生物學(xué)功能。有學(xué)者認(rèn)為，JAMs有調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、通透性和維持細(xì)胞形態(tài)的多重功能［14］。

總之，跨膜蛋白o(hù)ccludin和claudin均含有支架蛋白ZO-1的結(jié)合位點(diǎn)，從而固定于細(xì)胞骨架，使相鄰細(xì)胞以“拉鏈”形式連接細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞旁封閉，共同形成TJ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);occludin還能間接與肌動(dòng)蛋白和JAMs發(fā)生作用。這些結(jié)構(gòu)蛋白和連接蛋白組成了復(fù)雜的蛋白連接體系，共同維持食管黏膜屏障的完整性。

二、GERD中TJ蛋白的研究

以往對(duì)TJ蛋白的研究主要集中于炎癥性腸病、胰腺炎、肝臟疾病、惡性腫瘤等，近年對(duì)GERD食管黏膜中TJ蛋白的研究逐漸增多。Asaoka等［15］報(bào)道，反流性食管炎(RE)模型大鼠食管黏膜棘層和顆粒層糜爛附近的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中claudin-1表達(dá)增加，而claudin-4和occludin表達(dá)由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)，claudin-3表達(dá)明顯下降;這些TJ改變明顯影響了食管上皮細(xì)胞的通透性。Oguro等［16］發(fā)現(xiàn)，胃酸可誘導(dǎo)RE模型大鼠claudin-3從食管上皮細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，使TJ復(fù)合物穩(wěn)定性下降，這可作為RE炎癥和修復(fù)過程最特異、最敏感的指標(biāo)之一，有必要在臨床上檢測正常食管和RE食管黏膜中claudin的變化。另有研究［17］顯示，RE大鼠食管黏膜中 claudin-1、occludin、ZO-1、JAMs表達(dá)較對(duì)照組均明顯增高，但在單個(gè)食管上皮細(xì)胞中，上述蛋白表達(dá)減少，推測RE時(shí)TJ蛋白變化的分子機(jī)制為持續(xù)存在的食管損傷因素引起食管上皮局部細(xì)胞增殖，新增殖細(xì)胞間的TJ蛋白重新構(gòu)建，當(dāng)新的TJ蛋白構(gòu)建速度慢于細(xì)胞增殖速度時(shí)，上述蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)生障礙，即出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞TJ蛋白表達(dá)下降等現(xiàn)象。由于反流物破壞了食管黏膜claudin-1和occludin結(jié)構(gòu)，ZO-1不能將claudin-1連接到細(xì)胞膜，導(dǎo)致TJ復(fù)合體結(jié)構(gòu)的破壞，食管上皮細(xì)胞通透性增加，引起RE。

三、DIS與GERD

Hopwood等［18］首次報(bào)道了GERD患者食管上皮存在DIS。隨后大量研究均證實(shí)，GERD患者(包括NERD和EE)食管上皮普遍存在 DIS、細(xì)胞旁通透性增加［2，3，19］。Tobey等［20］發(fā)現(xiàn)，非糜爛性酸暴露引起的食管上皮DIS不僅與跨上皮電阻降低和細(xì)胞旁通透性增加有關(guān)，而且可作為酸暴露損傷食管的標(biāo)記。分子質(zhì)量為20 kDa的葡聚糖分子能彌散透過食管上皮層，證實(shí)了酸或酸化胃蛋白酶引起的細(xì)胞旁通透性增加是客觀存在的。越來越多的研究證實(shí)，DIS是食管上皮細(xì)胞連接破壞的標(biāo)記，亦是細(xì)胞旁通透性增加的標(biāo)記。

目前，DIS是GERD/EE的重要形態(tài)學(xué)特征這一觀點(diǎn)已被廣泛接受，采用光鏡或電鏡可對(duì)GERD/EE患者下段食管鱗狀上皮細(xì)胞的DIS進(jìn)行定量研究，或許可作為診斷、治療和隨訪的一種形態(tài)學(xué)標(biāo)記［3］。

DIS可由酸反流引起，心理應(yīng)激和膽汁酸反流亦可誘導(dǎo)DIS發(fā)生或持續(xù)存在。DIS使食管上皮對(duì)酸的通透性增加，酸彌散至黏膜層，引起炎癥細(xì)胞浸潤，這或許是GERD患者發(fā)生食管黏膜炎癥和燒心癥狀的機(jī)制［21］。Tadiparthi等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，DIS與RE患者的癥狀密切相關(guān)，但與NERD患者的癥狀尚無明顯關(guān)聯(lián);說明RE和NERD的發(fā)病機(jī)制可能不同，并可解釋這兩類患者在接受抑酸治療后的癥狀緩解率不同。

質(zhì)子泵抑制劑(PPI)可能有助于改善GERD患者食管上皮DIS。Calabrese等［23］的研究結(jié)果顯示，PPI治療3個(gè)月和6個(gè)月可分別使92.1%和97.4%的GERD患者食管上皮DIS完全消失，其中NERD患者和RE患者的DIS改善情況無明顯差異;DIS消失者的燒心癥狀均緩解。

四、TJ蛋白與DIS

食管黏膜的通透性取決于細(xì)胞通路(主要為胞膜)和細(xì)胞旁通路(主要為TJ)的完整性。在NERD動(dòng)物模型中，將食管黏膜暴露于酸或酸化的胃蛋白酶環(huán)境中，會(huì)使TJ復(fù)合物破壞，從而造成細(xì)胞旁通路對(duì)水、電解質(zhì)和小分子物質(zhì)的通透性增加，導(dǎo)致食管鱗狀上皮出現(xiàn)DIS［24］。

Farré等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，將食管黏膜短暫暴露于膽酸會(huì)引起食管上皮細(xì)胞TJ結(jié)構(gòu)破壞，上皮屏障的完整性受損，進(jìn)而引起DIS，這可能是部分GERD患者使用PPI治療后，癥狀仍持續(xù)存在的原因之一。Asaoka等［15］發(fā)現(xiàn)，RE時(shí)TJ蛋白表達(dá)和分布發(fā)生變化，這些改變可能導(dǎo)致了細(xì)胞旁通透性增加。最近一項(xiàng)研究［26］亦發(fā)現(xiàn)，酸、膽汁酸和胃蛋白酶均可通過調(diào)節(jié)食管上皮細(xì)胞TJ蛋白，破壞食管上皮屏障，使上皮細(xì)胞的通透性增加。

目前普遍認(rèn)為，GERD患者由于食管上皮TJ結(jié)構(gòu)和功能異常，細(xì)胞通透性增加并出現(xiàn)DIS，使H+、胃蛋白酶、膽汁酸等逆行彌散進(jìn)入上皮層，損害食管黏膜，并通過食管黏膜內(nèi)的瞬時(shí)受體電位香草酸亞型(TRPV)和酸敏感離子通道(ASIC)產(chǎn)生GERD的臨床癥狀［27］。

五、結(jié)語

GERD的發(fā)生機(jī)制已探討數(shù)十年。近年研究發(fā)現(xiàn)GERD患者的食管上皮存在TJ結(jié)構(gòu)和功能的異常(細(xì)胞旁通透性增加，進(jìn)而出現(xiàn)DIS)，可能與GERD的發(fā)生有關(guān)。但TJ蛋白與DIS的關(guān)系、NERD和EE患者癥狀與DIS的關(guān)系等仍需進(jìn)一步研究。明確這些問題將為GERD的診斷、治療甚至療效評(píng)估提供新的方向。

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