新的生物標(biāo)記物在膿毒癥診斷中的價(jià)值

解立新

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，病情進(jìn)展迅速，甚至在較短時(shí)間內(nèi)繼發(fā)多臟器功能障礙而危及患者生命，且具有發(fā)病率高、病死率高及治療耗資巨大的特點(diǎn)。雖然近些年來醫(yī)學(xué)科學(xué)有了很大的進(jìn)步，但是，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，膿毒癥造成的總死亡人數(shù)仍會持續(xù)上升，全球每天約有1400 人死于膿毒癥，高于急性心肌梗死、肺癌或乳腺癌致死人數(shù)。鑒于膿毒癥具有病情發(fā)展快、進(jìn)展迅速和病死率高的特點(diǎn)，尋找能夠早期明確診斷、準(zhǔn)確判斷疾病嚴(yán)重程度和對疾病預(yù)后進(jìn)行預(yù)判的臨床生物標(biāo)記物(Biomarkers)是臨床醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)之一。

1 臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，臨床常用的生物標(biāo)記物有白細(xì)胞(white blood cells，WBC)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)、白介素-6(interlukin-6，IL-6)等，對膿毒癥患者的及時(shí)診斷和治療發(fā)揮了重要作用。

1.1 白介素-6(Il-6) IL-6 主要由單核/巨噬細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞合成，可促進(jìn)肝臟合成急性期蛋白，激活T 淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞的終末期分化，成為具有分泌免疫球蛋白的免疫活性細(xì)胞，并具有多種生物學(xué)功能。在膿毒癥的預(yù)后評估中發(fā)揮著重要作用。

1.2 C-反應(yīng)蛋白(CRP) CRP 是由肝臟生成的血漿蛋白，會結(jié)合在死亡細(xì)胞或微生物外膜上的磷酸膽堿，以活化補(bǔ)體系統(tǒng)，當(dāng)體內(nèi)有急性炎性反應(yīng)、細(xì)菌感染、組織的損傷時(shí)，CRP 在數(shù)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)，而疾病治愈后又很快消失，是一種非特異的炎性反應(yīng)標(biāo)志物。CRP 并不適用于單一疾病的診斷，其臨床價(jià)值主要在于組織損傷的篩檢和監(jiān)測。

1.3 降鈣素原(PCT) PCT為一種糖蛋白，是降鈣素(CT)的前體。正常情況下，血清PCT 的濃度極低，基本不能被檢測出來，在感染等炎性反應(yīng)刺激下，尤其是合并有嚴(yán)重菌血癥、感染性休克時(shí)，PCT會明顯升高，被認(rèn)為是評價(jià)感染嚴(yán)重程度很有價(jià)值的生物標(biāo)記物。

但是，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，上述生物標(biāo)記物遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有起到預(yù)期的作用。筆者研究發(fā)現(xiàn)，WBC 和CRP在早期鑒別膿毒癥和SIRS 方面沒有優(yōu)勢，在動態(tài)評價(jià)疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后上也不具有較好的臨床價(jià)值［1，2］。PCT 雖然對疾病預(yù)后評價(jià)具有重要價(jià)值，但在膿毒癥早期診斷方面沒有優(yōu)勢，對膿毒癥嚴(yán)重程度評估也不夠理想［2-4］。Pierrakos 等［5］對用于膿毒癥評估的生物標(biāo)記物做了文獻(xiàn)薈萃分析，發(fā)現(xiàn)雖然已有多種生物標(biāo)記物用于臨床檢測，但主要用于預(yù)后評估，且由于在臨床實(shí)踐中缺乏足夠的特異性或敏感性，用于膿毒癥診斷的生物標(biāo)記相對較少，在診斷膿毒癥方面具有很好的敏感性和特異性的生物標(biāo)記物尚未發(fā)現(xiàn)。因此，需要尋找新的生物標(biāo)記物為臨床服務(wù)。

2 新的生物標(biāo)記物

2.1 髓系細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體-1 髓系細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體-1(TREM-1)是一種特異性表達(dá)髓系細(xì)胞的受體，按照所處位置不同，可分為膜結(jié)合型和可溶性(solubleTREM-1，sTREM-1)兩種形式，由Bouchon 等于2000年發(fā)現(xiàn)。TREM 屬于免疫球蛋白超家族受體，人的TREM 編碼基因位于染色體6p21，與MHC II 區(qū)域相鄰。人的TREM-1 表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，由含194個(gè)氨基酸殘基的胞外域、29個(gè)氨基酸的跨膜域和5個(gè)氨基酸的胞漿域組成。跨膜區(qū)域的1個(gè)帶正電荷的賴氨酸殘基與接頭蛋白DAP12 跨膜區(qū)帶負(fù)電荷的天冬氨酸殘基偶聯(lián)，從而使ITAM 酪氨酸激酶殘基磷酸化，通過激活ZAP70 和非受體型酪氨酸激酶(SYK)，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+動員、肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)及多種轉(zhuǎn)錄因子活化，最終導(dǎo)致促炎因子的釋放，放大宿主對微生物成分的應(yīng)答，從而放大炎性反應(yīng)。TREM-1的自然配體可能是直接的微生物成分，如脂多糖LPS，也可能是由感染和(或)組織壞死所產(chǎn)生并釋放入血的內(nèi)源性可溶性或膜結(jié)合型蛋白，在炎性反應(yīng)鏈中具有重要作用，可介導(dǎo)多種促炎因子，如TNF-α、IL-1β 和GM-CSF 的產(chǎn)生，對膿毒癥的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。筆者研究發(fā)現(xiàn)，血清sTREM-1 在早期鑒別膿毒癥和SIRS，對疾病嚴(yán)重程度評估和預(yù)后評價(jià)等方面均優(yōu)于CRP、PCT［2］。盡管血清sTREM-1 對于鑒別診斷監(jiān)護(hù)病房不明原因發(fā)熱患者是否患菌血癥的價(jià)值有限，但是其判斷菌血癥患者的預(yù)后具有較好的價(jià)值［6］。將血清sTREM-1 用于評價(jià)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(ventilator-associated pneumonia，VAP)的研究提示，血清sTREM-1 +WBC+CPIS 評分聯(lián)合診斷VAP 的效能最高［7］。此外，尿液sTREM-1 對早期急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的診斷甚至優(yōu)于血清肌酐(serum creatinine，sCr)［8］。由于血清sTREM-1 對膿毒癥診斷及其預(yù)后判斷的重要價(jià)值，筆者檢測了79例膿毒癥患者和80例健康者TREM-1 基因的四個(gè)外顯子上的SNP 變化，發(fā)現(xiàn)TREM-1 基因位點(diǎn)rs2234237 的變化與膿毒癥的預(yù)后有關(guān)，并影響膿毒癥患者的生存時(shí)間;如果患者的該位點(diǎn)發(fā)生變化，其患膿毒癥后預(yù)后不良的概率會大大增高［9］。

2.2 清道夫受體CD163 人類CD163 是一種糖蛋白，是表達(dá)在巨噬細(xì)胞膜上唯一的血紅蛋白受體。CD163 以兩種形式存在，一種以膜結(jié)合型存在，膜結(jié)合形式經(jīng)過蛋白酶切割后胞外區(qū)脫落入體液中形成另一種形式，即soluble CD163(sCD163)。在生理和病理情況下，紅細(xì)胞破裂后釋放到紅細(xì)胞外的血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白結(jié)合，通過膜上的CD163 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被單核-巨噬細(xì)胞吞噬?，F(xiàn)有的研究證明，sCD163 是一種早期的急性時(shí)相蛋白，在機(jī)體初始的抗炎反應(yīng)中可能具有重要作用。筆者發(fā)現(xiàn)，外周血sCD163 在早期鑒別膿毒癥和對疾病預(yù)后評價(jià)方面優(yōu)于CRP 和PCT，但是對疾病動態(tài)變化的評價(jià)價(jià)值有限［10-12］。筆者檢測了膿毒癥患者尿液sCD163 的水平，發(fā)現(xiàn)尿液sCD163 對診斷膿毒癥、疾病嚴(yán)重程度評估和AKI 預(yù)判同樣具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值［1，11］。筆者還對外周血sTREM-1、sCD163、PCT、CRP 和WBC進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)sTREM-1 在膿毒癥診斷和嚴(yán)重程度評價(jià)方面具有明顯的優(yōu)勢，而sCD163 在動態(tài)評價(jià)疾病預(yù)后方面效果最佳。

2.3 新的外周血miRNA 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼的長度約22 nt 的小分子RNA，它能夠在轉(zhuǎn)錄后水平通過介導(dǎo)mRNAs裂解或抑制翻譯來調(diào)控mRNAs 的表達(dá)。研究證明，miRNAs 不僅參與宿主固有免疫反應(yīng)的調(diào)控，還參與適應(yīng)性免疫的調(diào)控，并且在抗感染方面也發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，血清中的miRNA 是抗核糖核酸酶和DNA 酶消化的，而且反復(fù)凍融、高或低的pH 環(huán)境對miRNA 均沒有顯著的影響，因此在不同患者中多次檢測同一miRNA 的水平也體現(xiàn)其含量的可重復(fù)性和一致性。筆者發(fā)現(xiàn)，血清miR-223、miR-15a、miR-16、miR-193b*、miR-574-5p、miR-483-5p 和miR-297 可以用于膿毒癥預(yù)后的評價(jià)，并且二分類變量logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-193b* 的相對危險(xiǎn)度高達(dá)9.23，高于常用指標(biāo)APACHEⅡ評分和SOFA 評分。在這些預(yù)后相關(guān)的miRNAs 中，miR-15a 和miR-16 可以用來區(qū)分膿毒癥和健康對照，而miR-15a 可以用來區(qū)分膿毒癥患者和全身炎性反應(yīng)綜合征［3，4，13，14］。對筆者上述驗(yàn)證得到的膿毒癥相關(guān)的miRNAs 進(jìn)行靶基因預(yù)測和靶基因通路注釋，得到5個(gè)膿毒癥相關(guān)的靶基因。筆者測定了這些靶基因編碼蛋白在膿毒癥患者血清中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，其中的4個(gè)蛋白在生存患者和死亡患者血清中有差異表達(dá)。動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)ACVR2A 和FOXO1 可以作為膿毒癥患者的血清標(biāo)記物。既往研究也發(fā)現(xiàn)FOXO1 是miR-223 的靶基因［15］。這說明，不僅血清miRNAs 可以作為膿毒癥患者的血清標(biāo)記物，這些miRNAs 靶基因的編碼蛋白也可以作為標(biāo)記物。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)的研究 兩研究都是翻譯后水平的研究，是發(fā)揮生物學(xué)功能的最終階段。腎臟在膿毒癥的發(fā)生過程中極易受累，這已被越來越多的臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)。在膿毒癥發(fā)生時(shí)，血流動力學(xué)的變化會使腎小球?yàn)V過率降低;腎臟局部炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，以及毒性損傷會導(dǎo)致細(xì)胞損傷和濾過屏障功能破壞，這些因素最終可發(fā)生腎臟功能損傷或者衰竭［16，17］。因此，尿液成為一種很好的生物樣本研究材料，其中的某些蛋白分子有可能成為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，而且這種無創(chuàng)性的檢查可以提高檢測準(zhǔn)確度，減少患者痛苦并節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。筆者通過iTRAQ 蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生膿毒癥時(shí)，患者尿液中的血紅蛋白、鈣黏蛋白-1、銅藍(lán)蛋白、補(bǔ)體C3、α1抗胰蛋白酶會發(fā)生顯著的改變;而硒約束蛋白、硫酸肝素蛋白多糖、載脂蛋白、血紅蛋白、α1-B 糖蛋白、溶酶體相關(guān)膜蛋白-1、二肽基肽酶能夠提示膿毒癥的不良預(yù)后，并通過Western Blot 技術(shù)驗(yàn)證了患者早期溶酶體相關(guān)膜蛋白-1 的顯著減低可能提示預(yù)后不良［18，19］。

代謝組學(xué)方法為探討膿毒癥的生物標(biāo)志物和相關(guān)機(jī)制提供了一個(gè)新的視野。筆者研究結(jié)果提示，膿毒癥的代謝紊亂十分復(fù)雜，涉及氨基酸水平、肉堿和酰胺類濃度、甘油磷脂及花生四烯酸類代謝水平明顯的異常。半胱氨酸隨著膿毒癥的加重而逐漸減低，能夠反映了膿毒癥疾病的嚴(yán)重程度，并揭示了膿毒癥發(fā)病過程中氧化損傷和炎性反應(yīng)加劇的機(jī)制。同時(shí)，從代謝動力學(xué)來看，丙烯酰肉堿貫穿在膿毒癥發(fā)生發(fā)展的始終，提示其可能是一種潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。

2.5 貫穿組學(xué)技術(shù) 隨著高通量技術(shù)的發(fā)展和系統(tǒng)生物學(xué)理論的不斷完善，人們越來越認(rèn)識到不能單單從一個(gè)組學(xué)的角度去解釋一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象和本質(zhì)。因此，如何將基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合成為貫穿組學(xué)，以解釋功能和發(fā)病機(jī)制，成為了目前研究的前沿問題。但是，進(jìn)行相關(guān)研究并非是對高尖技術(shù)的簡單套用，應(yīng)根據(jù)疾病的特點(diǎn)、病理類型、臨床分期等，因病制宜地選擇相應(yīng)的技術(shù)手段，去解釋高通量所帶來的海量數(shù)據(jù)。如果能將這些技術(shù)充分應(yīng)用并相互結(jié)合和補(bǔ)充，必將進(jìn)一步闡明膿毒癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。理論上講，通過膿毒癥的多組學(xué)多層次貫穿研究，能夠?qū)δ摱景Y的理論和臨床研究尋找到新的發(fā)現(xiàn)和新的思路。

2.6 T 細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白-3(T cell Ig and mucin domain protein 3，Tim-3) 是Tim 家族中的一員，最初在分泌IFN-γ 的CD4+T 淋巴細(xì)胞的Th1 亞群和CD8+的Tc1 細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)［20，21］，通過與其配體Gal-9 結(jié)合，Tim-3 可誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡和免疫耐受。另外，Tim-3 還表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞表面并參與了天然免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)［22］。近期研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥的發(fā)病過程中，Tim-3 通過下調(diào)TLR 的應(yīng)答來抑制巨噬細(xì)胞的過度活化，中和Tim-3 后，機(jī)體巨噬細(xì)胞的活性增強(qiáng)，膿毒癥的病情加重，提示Tim-3 作為一種新型免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)分子參與了膿毒癥抗炎與促炎平衡的調(diào)節(jié)［23］。筆者檢測了膿毒癥不同病情嚴(yán)重程度下外周血單核細(xì)胞膜表面的Tim-3 水平，發(fā)現(xiàn)Tim-3 的表達(dá)量對于膿毒癥病情嚴(yán)重程度的評估優(yōu)于CRP、APACHEⅡ評分和SOFA 評分，而在評估患者預(yù)后方面的價(jià)值稍差。Tim-3 在膿毒癥患者外周血單核細(xì)胞膜表面的低表達(dá)提示病情嚴(yán)重，預(yù)后不良。目前對于Tim-3 的后續(xù)研究仍在進(jìn)行中。

［1］蔣朝旭.可溶性髓系細(xì)胞表達(dá)觸發(fā)受體-1 在膿毒癥中的應(yīng)用［D］.天津:南開大學(xué)，2012.

［2］Zhang J，She D Y，F(xiàn)eng D，et al.Dynamic changes of serum soluble triggering receptorexpressed on myeloid cells-1 (sTREM-1)reflect sepsis severity and can predict prognosis:a prospective study［J］.BMC Infect Dis，2011，11:53.

［3］Wang H J，Meng K，Chen W J，et al.Serum miR-574-5p:a prognostic predictor of sepsis patients［J］.SHOCK，2012，37(3):263-267.

［4］Wang H J，Zhang P J，Chen W J，et al.Serum MicroRNA Signatures Identified by Solexa Sequencing Predict Sepsis Patients＇Mortality:A Prospective Observational Study［J］.PLoS ONE，2012，7(6):e38885.

［5］Pierrakos C，Vincent J L.Sepsis biomarkers:a review［J］.Crit Care.2010，14(1):R15.

［6］Su L X，Han B C，Liu C T，et al.Value of soluble TREM-1，procalcitonin，and C-reactive protein serum levels as biomarkers for detecting bacteremia among sepsis patients with new fever in intensive care units:a prospective cohort study［J］.BMC Infect Dis，2012，12:157.

［7］Su L X，Meng K，Zhang X，et al.Diagnostic Value of sTREM-1 and Procalcitonin Serum Levels and Pulmonary Infection Score for Ventilator-associated Pneumonia among ICU Sepsis Patients［J］.AM J CRIT CARE，2012，21(6):e110-e119..

［8］Su L X，F(xiàn)eng L，Zhang J，et al.Diagnostic Value of Urine sTREM-1 for Sepsis ＆ Relevant Acute Kidney Injuries:a prospective study［J］.Crit Care，2011，15:R250.

［9］Su L X，Liu C T，Li C，et al.Dynamic Changes in Serum Soluble Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1 (sTREM-1)and its Gene Polymorphisms are Associated with Sepsis Prognosis［J］.Inflammation.2012，14:235-238.

［10］馮 林.sCD163 在膿毒癥中的應(yīng)用［D］.天津:南開大學(xué)，2011.

［11］Feng L，Zhou X，Su L X，et al.Clinical significance of soluble hemoglobin scavenger receptor CD163(sCD163)in sepsis，a prospective study［J］.PLoS ONE，2012，7(7):e38400.

［12］Su LX，F(xiàn)eng L，Liu C T，et al.Diagnostic value of urine sCD163 levels for sepsis and relevant acute kidney injury:a prospective study［J］.BMC Nephrology，2012，13(1):123.

［13］王慧娟.膿毒癥患者血清miRNA 全基因組篩選及對患者預(yù)后的評價(jià)研究［D］.天津:南開大學(xué)，2011.

［14］Wang H，Zhang P，Chen W，et al.Evidence for serum mir-15a and mir-16 levels as biomarkers that distinguish sepsis from systemic inflammatory response syndrome in human subjects［J］.Clinical chemistry and laboratory medicine :CCLM/ FESCC，2012，50:1423-1428.

［15］Wu L，Li H，Jia C Y，et al.Microrna-223 regulates foxo1 expression and cell proliferation［J］.FEBS letters，2012，586:1038-1043.

［16］Ricci Z，Ronco C.Pathogenesis of acute kidney injury during sepsis［J］.Curr Drug Targets，2009，10:1179-1183.

［17］Vincent J L.Acute kidney injury，acute lung injury and septic shock:how does mortality compare［J］?Contrib Nephrol，2011，174:71-77.

［18］Su L，Zhou R，Liu C，et al.Urinary proteomics analysis for sepsis biomarkers with iTRAQ labeling and twodimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Journal of trauma and acute care surgery，2013，74(3):940-945.

［19］Su L，Cao L，Zhou R，et al.Identification of novel biomarkers for sepsis prognosis via urinary proteomic analysis using iTRAQ labeling and 2D-LC-MS/MS［J］.PLoS ONE，2013，8(1):e54237.

［20］Sanchez F A，Tian J，Picarella D，et al.Tim-3 inhibits T helper type 1-mediated auto-and alloimmune responses and promotes immunological tolerance［J］.Nature immunology，2003，4(11):1093-1101.

［21］Chiba S，Baghdadi M，Akiba H，et al.Tumor-infiltrating DCs suppress nucleic acid-mediated innate immune responses through interactions between the receptor TIM-3 and the alarmin HMGB1［J］.Nature immunology 2012，13(9):832-842.

［22］Hastings W D，Anderson D E，Kassam N，et al.TIM-3 is expressed on activated human CD4+T cells and regulates Th1 and Th17 cytokines［J］.European journal of immunology，2009，39(9):2492-2501.

［23］Yang X，Jiang X，Chen G，et al.T cell Ig mucin-3 promotes homeostasis of sepsis by negatively regulating the TLR response［J］.J Immunol，2013，190(5):2068-2079.