以外泌體為基礎(chǔ)的液體活檢在胰腺癌診斷中的研究進(jìn)展

郭馬娣，趙娟，黃小義

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer,PC）是一種預(yù)后較差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌發(fā)病率在男性居第10位，女性居第9位，而死亡率均居第4位[1]。由于胰腺癌起病隱匿、早期缺乏特異癥狀及敏感的生物學(xué)診斷標(biāo)志物，多數(shù)患者初診時(shí)已經(jīng)進(jìn)展到晚期，失去最佳治療時(shí)機(jī)，整體5年生存率僅為9%[2]。因此，篩選高敏感度和特異性的胰腺癌診斷標(biāo)志物，提高胰腺癌的早期診斷率，使患者得到及時(shí)治療，對(duì)于提高患者生存預(yù)后具有重要意義。

近年來(lái)，液體活檢技術(shù)的出現(xiàn)是腫瘤診療領(lǐng)域的重大突破[3]，通過(guò)捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）、循環(huán)腫瘤RNA（circulating tumor RNA,ctRNA）及外泌體（exosome），分析腫瘤衍生的循環(huán)核酸、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)來(lái)解讀惡性腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程，在腫瘤的早期診斷、檢測(cè)治療效果、追蹤患者復(fù)發(fā)方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。其中外泌體因其廣泛存在于各種體液中，易于富集，提取簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)，其內(nèi)容物核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等活性成分表達(dá)豐富、穩(wěn)定，成為各類腫瘤診斷的潛在生物標(biāo)志物研究熱點(diǎn)。本文就外泌體在胰腺癌診斷中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1 形成

外泌體是直徑約40～160 nm、具有脂質(zhì)雙分子膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡[4]，由多種機(jī)體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生并釋放到各種體液中。外泌體的形成過(guò)程主要包括質(zhì)膜的兩次內(nèi)陷及細(xì)胞內(nèi)多囊泡小體的形成（intracellular multivesicular bodies,MVBs）。質(zhì)膜的第一次內(nèi)陷形成包含有細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞外環(huán)境中可溶性蛋白的杯狀結(jié)構(gòu)，這也是早期分選內(nèi)體（early-sorting endosome,ESE）的從頭形成過(guò)程。ESE在細(xì)胞內(nèi)逐漸成熟為晚期分選內(nèi)體（late-sorting endosomes,LSE），其質(zhì)膜的再次內(nèi)陷形成包含大量腔內(nèi)小泡（intraluminal vesicles,ILV）的MVB，MVBs既可以與溶酶體或自噬小體融合降解，也可以通過(guò)與細(xì)胞膜的融合和胞吐作用將ILVs分泌出細(xì)胞，這些被釋放出的直徑約40～160 nm的小囊泡就是外泌體[5]。已有研究提出相比正常細(xì)胞，癌細(xì)胞分泌更多的外泌體[6]。

1.2 分離和檢測(cè)

目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多技術(shù)可以分離得到濃度和純度均較高的外泌體，如超速離心法（ultracentrifugation,UC）、超濾、尺寸排阻色譜、成品化學(xué)試劑盒、磁珠免疫吸附法、微流體分離法等[7]，其中UC是最常用的富集外泌體的方法。納米粒子示蹤分析（NTA）、透射電子顯微鏡（TEM）等可用來(lái)檢測(cè)分離得到的外泌體形態(tài)學(xué)特征，Western blot、流式細(xì)胞術(shù)常用于分析和檢測(cè)外泌體標(biāo)志物[8]。此外，還有很多方法可以用來(lái)檢測(cè)外泌體中的蛋白質(zhì)和核酸成分。這些成熟的外泌體分離提取及鑒定技術(shù)是外泌體相關(guān)研究順利進(jìn)行的基礎(chǔ)和保障。

1.3 主要成分

外泌體組成成分包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、RNA和各類代謝物等[9]，這些內(nèi)容物與其來(lái)源的細(xì)胞密切相關(guān)，可確切反映親代細(xì)胞特征。外泌體內(nèi)包含的核酸有DNA和RNA，RNA包括非編碼RNA和mRNA，其中非編碼RNA可以通過(guò)細(xì)胞間通訊和組織微環(huán)境調(diào)控作用參與不同的生理、病理途徑，尤其是小核糖核酸（miRNA）在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因調(diào)控[10]，與包括胰腺癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11-12]，LncRNA和CircRNA可以通過(guò)吸附miRNA、抑制miRNA活性來(lái)發(fā)揮作用。根據(jù)外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)的資料，從外泌體已鑒定出2 000多種蛋白質(zhì)，主要包括跨膜蛋白、脂質(zhì)錨定膜蛋白、外周相關(guān)膜蛋白和外泌體腔內(nèi)的可溶性蛋白[4]，其中四跨膜蛋白家族的CD81、CD63、CD9，熱休克蛋白家族的Hsp27、Hsp90、Hsp70以及細(xì)胞分選復(fù)合物TSG101共同成為最常用的外泌體標(biāo)記蛋白[13]。外泌體膜含有不同豐度的磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、膽固醇和鞘磷脂等[4]，這些脂類可參與外泌體形成和釋放。此外，脂質(zhì)成分及其穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)使外泌體具有更高的滲透性和循環(huán)穩(wěn)定性，可作為藥物輸送的載體[14]。通過(guò)對(duì)外泌體攜帶的生物活性成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)從腫瘤患者體液分離得到的外泌體可以作為腫瘤重要的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

2 外泌體在胰腺癌診斷中的作用

胰腺癌的傳統(tǒng)診斷方法主要有影像學(xué)、血液生物標(biāo)志物CA199、CEA以及超聲引導(dǎo)穿刺活檢等方法[15]，而確診通常需要侵入性手段，因此受到應(yīng)用限制，使其在胰腺癌早期診斷上的作用十分有限。已經(jīng)有研究表明胰腺癌患者體液中的外泌體內(nèi)一些分子特異性的存在或表達(dá)，可以作為一種新型的胰腺癌診斷生物標(biāo)志物。

2.1 外泌體RNA與胰腺癌診斷

2.1.1 外泌體非編碼RNA miRNA是一類非編碼核糖核酸分子，由21～25個(gè)核苷酸組成[16]。富集于外泌體中的miRNA，因外泌體膜結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其不受核糖核酸酶干擾，使其在不同理化性質(zhì)下均較為穩(wěn)定，這為利用外泌體miRNA作為惡性腫瘤的早期診斷標(biāo)志物創(chuàng)造了條件[17]。目前已有研究表明血清外泌體中miRNA可作為胰腺癌早期診斷標(biāo)志物。Zou等[18]構(gòu)建了一個(gè)血清外泌體6-miRNA組，包括let-7b-5p、miR-192-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-223-3p和miR-25-3p，ROC曲線分析表明這六種miRNA共同參與診斷時(shí)曲線下面積（Area Under Curve,AUC）為0.910，證明了miRNA生物標(biāo)志物的組合可能比單一標(biāo)志物具有更好的診斷性能。Zhou等[19]也評(píng)估了外泌體miRNA作為生物標(biāo)志物在診斷PC中的潛在用途，發(fā)現(xiàn)PC患者血清外泌體miR-122-5p和miR-193b-3p上調(diào)，而miR-221-3p下調(diào)，ROC分析顯示外泌體miR-122-5p和miR-193b-3p的AUC與血漿中miRNA相似。Kawamura等[20]通過(guò)分析55例胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）患者和20例健康志愿者門(mén)靜脈血（PVB）及外周血（PB）血漿中的外泌體，發(fā)現(xiàn)PDAC患者PVB外泌體miR-4525、miR-451a和miR-21水平顯著高于PB，可作為診斷胰腺癌及判斷術(shù)后復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物。Goto等[21]在對(duì)32例PC患者和29例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤（intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN）患者的研究中發(fā)現(xiàn)，與22例對(duì)照組健康志愿者相比，血清外泌體miR-191、miR-21和miR-451a在PC和IPMN中的表達(dá)上調(diào)，此外ROC分析還表明，外泌體miRNA對(duì)于區(qū)分對(duì)照組和早期胰腺癌（Ⅰ期和ⅡA期）患者的準(zhǔn)確性優(yōu)于CEA，其中miR-21的診斷準(zhǔn)確性達(dá)80.8%。Pu等[22]運(yùn)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體納米顆粒生物芯片檢測(cè)36例PC患者和65例健康人外周血血漿外泌體miR-21，也證明了PC組外泌體miR-21表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，ROC分析同時(shí)表明其診斷性能較優(yōu)（P=0.0003;AUC為0.7171）。

除了血漿，在其他體液中的外泌體miRNA也顯示了胰腺癌診斷的潛在價(jià)值，如Yoshizawa等[23]發(fā)現(xiàn)PDAC患者尿液外泌體中miR-3940-5p/miR-8069比值升高，且升高趨勢(shì)明顯高于血清，該比值與CA19-9聯(lián)合診斷PDAC可將敏感度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別提高到93.0%和78.4%，可作為一項(xiàng)新型胰腺癌CA19-9聯(lián)用診斷標(biāo)志物。到目前為止，一些研究[24-25]已經(jīng)證明了單獨(dú)或聯(lián)合多種miRNA在診斷胰腺癌、區(qū)分胰腺癌與胰腺非惡性疾病的潛在作用。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA[26]。目前，已經(jīng)在包括胰腺癌在內(nèi)的多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了外泌體LncRNAs的異常表達(dá)[27-28]。Takahashi等[29]鑒定出一種血清外泌體lncRNA-HULC，并證明了其作為PC診斷標(biāo)記的效率（AUC為0.92）。Kumar等[30]研究發(fā)現(xiàn)PC和IPMN患者血清外泌體中LncRNA MALAT-1和CRNDE較健康者特異性過(guò)表達(dá)，可以區(qū)分PC、IPMN和健康者。在另一項(xiàng)研究中，對(duì)501例受試者（包括284例PDAC患者、100例慢性胰腺炎患者和117例健康受試者）的血漿樣本提取的外泌體進(jìn)行RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)長(zhǎng)鏈RNA包括FGA、KRT19、HIST1H2BK、ITIH2、MARCH2、CLDN1、MAL2和TIMP1的表達(dá)在各組間有明顯差異，它們?cè)趨^(qū)分胰腺癌和慢性胰腺炎方面表現(xiàn)出優(yōu)于CA19-9的性能（AUC為0.931）[31]。

近年來(lái)，環(huán)狀RNA（circRNA）作為一種新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到了人們的關(guān)注[32]。circRNA的相對(duì)穩(wěn)定性和物種間的進(jìn)化保守性賦予它作為癌癥的潛在生物標(biāo)志物的實(shí)用價(jià)值，有研究證明circ-IARS、circ-PDE8A在胰腺癌外泌體中表達(dá)升高，且過(guò)表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[33-34]，可能是PDAC早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。

核仁小RNA（snoRNA）是分布于真核生物細(xì)胞核仁的小分子非編碼RNA，具有保守的結(jié)構(gòu)元件[35]。在一項(xiàng)27例胰腺癌患者和13例對(duì)照的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，血清外泌體中SNORA74A和SNORA25l聯(lián)合CA19-9在區(qū)分胰腺癌患者與對(duì)照組時(shí)的AUC面積均大于0.9（AUC為0.946和0.940），高于CA19-9單獨(dú)診斷效率（AUC 0.897）[36]。

以上這些相關(guān)研究提示外泌體非編碼RNA在胰腺癌的診斷和治療上的應(yīng)用前景廣闊，但是，由于外泌體中RNA含量豐富，目前各研究均是單中心，患者數(shù)量較少，體液種類和外泌體提取方法等均存在差異，導(dǎo)致不同研究結(jié)果的差異大、重現(xiàn)性差，無(wú)法提供確切的適用于胰腺癌診斷的RNA標(biāo)記，因此還需要進(jìn)行多中心、擴(kuò)大樣本量的研究。

2.1.2 外泌體mRNA 在最新的一項(xiàng)研究中，Kumar等[30]通過(guò)分離和鑒定血清中的外泌體，并通過(guò)下一代測(cè)序（EXO-NGS）分析外泌體中存在的各種RNA，發(fā)現(xiàn)在不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本中，MMP8、TBX3、PDX1、CTSL、SIGLEC15等在PDAC患者中有更高的表達(dá)。此前，Kitagawa等在PC患者血清外泌體中還檢測(cè)到4種mRNAs（CCDC88A/ARF6/VAV3/WASF2），其中WASF2和ARF6表達(dá)水平的改變可以有效地區(qū)分PC患者和健康者[36]。Hu等[37]利用一種與陽(yáng)離子脂質(zhì)-聚合物混合納米顆粒（lipid–polymer hybrid nanoparticles,LPHN）相連的生物芯片可以與血清中外泌體結(jié)合形成LPHN-EV復(fù)合物，LPHN中合成的發(fā)夾狀DNA環(huán)（catalyzed hairpin DNA circuit,CHDC）與外泌體中的GPC1 mRNA結(jié)合放大信號(hào)，可以將胰腺癌和胰腺良性腫瘤、健康者區(qū)分開(kāi)。Yang等[38]使用磁性納米孔裝置從89例PC患者、44例胰腺良性疾病和71例健康者血漿中提取外泌體，分析外泌體來(lái)源的miRNA、mRNA、循環(huán)DNA（ccfDNA）KRAS G12D/V/R突變及血清CA19-9對(duì)胰腺癌的診斷效能，發(fā)現(xiàn)EV-miR-409、EV-CK18 mRNA、EVCD63 mRNA、ccfDNA濃度和CA19-9在內(nèi)的五個(gè)潛在生物標(biāo)志物的聯(lián)合診斷優(yōu)于CA19-9單獨(dú)診斷效能（AUC為0.95vs.0.92）。以上研究顯示了外泌體mRNA在胰腺癌診斷方面的潛在價(jià)值。

2.2 外泌體DNA與胰腺癌診斷

最近許多研究發(fā)現(xiàn)，外泌體DNA的一些基因組突變也是重要的診斷標(biāo)志物[39]，并且已經(jīng)建立起較為成熟的外泌體DNA突變的檢測(cè)方法[40]，這為利用患者血清或血漿中外泌體DNA診斷胰腺癌提供了可能。KRAS和P53是目前已知在胰腺癌患者中突變率較高的兩個(gè)基因[41]。Yang等[42]在48例PC患者血清外泌體中檢測(cè)到KRASG12D突變率為39.6%，而p53突變率為4.2%，提示循環(huán)外泌體DNA對(duì)于快速、低成本識(shí)別癌癥相關(guān)突變具有應(yīng)用價(jià)值。Allenson等[43]對(duì)121例個(gè)體（39例胰腺癌患者、82例健康對(duì)照者）進(jìn)行了隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組、局限型、局部進(jìn)展型和轉(zhuǎn)移性PDAC患者血漿外泌體中KRAS突變的檢出率分別為7.4%、66.7%、80%和85%，對(duì)比之下血漿游離KRAS突變基因的檢出率只有14.8%、45.5%、30.8%和57.9%。在隨后的研究中Bernard等也驗(yàn)證了檢測(cè)外泌體中的DNA可獲得更高的基因突變檢出率[44]，研究還表明外泌體中較高的KRAS突變與局限型PDAC患者的無(wú)疾病生存期（DFS）降低相關(guān)[43-44]。此外，Castillo等[45]利用蛋白組學(xué)分析鑒定出外泌體表面的多個(gè)PDAC特異性標(biāo)志物：CLDN4、EpCAM、CD151、LGALS3BP、HIST2H2BE和HIST2H2BF，在接受積極治療的PDAC患者中，44.1%的患者檢測(cè)到外泌體中的KRAS突變，而使用以上候選標(biāo)志物捕獲特異性外泌體后，這一比例提高到了73.0%。以上這些研究顯示了外泌體DNA作為診斷PC的潛在生物標(biāo)志物價(jià)值。

2.3 外泌體蛋白和胰腺癌診斷

近年來(lái)，外泌體蛋白作為診斷胰腺癌的重要生物標(biāo)志物受到越來(lái)越多的關(guān)注，并且已經(jīng)有一些研究證明了其診斷價(jià)值。其中最引人注意的是，Melo等[46]鑒定出了一種特異性富集在癌細(xì)胞外泌體表面的蛋白多糖—Glypican-1（GPC1），并提出GPC1可作為一種潛在的無(wú)創(chuàng)性診斷和篩查工具來(lái)發(fā)現(xiàn)早期胰腺癌。該研究證明了PC患者血清中GPC1陽(yáng)性循環(huán)外泌體的水平較高，且GPC1陽(yáng)性外泌體也被證實(shí)含有KRAS基因突變，使用GPC1區(qū)分胰腺癌、胰腺癌前病變和胰腺良性疾病的敏感度和特異性均可達(dá)到100%。此后，F(xiàn)rampton等[47]檢測(cè)胰腺癌患者（n=27）手術(shù)前后血漿GPC1陽(yáng)性外泌體的比例，發(fā)現(xiàn)術(shù)后其陽(yáng)性比例明顯降低，提出GPC1可能與腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)。Buscail等[48]創(chuàng)新性地使用抗GPC1與抗CD63偶聯(lián)的磁珠來(lái)分離和捕獲血液中的GPC1陽(yáng)性外泌體，發(fā)現(xiàn)CD63-GPC1雙陽(yáng)性外泌體聯(lián)合CA19-9檢測(cè)可進(jìn)一步提高胰腺癌的診斷準(zhǔn)確率?？偟膩?lái)說(shuō)，這些研究證明了循環(huán)GPC1陽(yáng)性外泌體是檢測(cè)和篩查胰腺癌患者的一個(gè)較好的候選標(biāo)志物，其臨床應(yīng)用價(jià)值還需要進(jìn)一步研究。

Sharma等[49]通過(guò)定量評(píng)估患者血漿外泌體磷脂酰絲氨酸（PS）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在組織病理學(xué)確診之前就已經(jīng)升高，可以作為超早期的胰腺癌患者生物標(biāo)志物及PC的早期篩查。Liang等[50]設(shè)計(jì)了一種快速而超敏感的納米等離子體增強(qiáng)散射（NPES）分析方法，可以直接從低至1 μl的血漿中定量腫瘤來(lái)源的外泌體，用該方法篩選出外泌體EphA2作為診斷PC的候選標(biāo)志物，并證明其在區(qū)分PC和胰腺炎方面的有效性（AUC為0.96），外泌體EphA2的診斷價(jià)值在隨后的研究中也得到了進(jìn)一步的證實(shí)[51]。Jin等[52]研究了24例PC患者和32例胰腺良性疾病患者血清外泌體ZIP4水平，發(fā)現(xiàn)ZIP4水平的升高對(duì)胰腺癌顯示出較較高的診斷價(jià)值（AUC為0.89）。此外，CKAP4、c-met、PD-L1、ALIX等多種蛋白作為胰腺癌診斷標(biāo)志物受到眾多研究者的關(guān)注[53-55]。由上述可見(jiàn)外泌體蛋白可能會(huì)顯著提高PC診斷的敏感度和特異性，而聯(lián)合外泌體DNA和RNA檢測(cè)，可能會(huì)成為臨床上早期診斷胰腺癌的有效生物標(biāo)志物。

2.4 外泌體脂質(zhì)和胰腺癌診斷

外泌體通常富含膽固醇、鞘磷脂和磷脂酰絲氨酸等脂質(zhì)，且含量復(fù)雜多變[56]。Tao等[57]基于液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）對(duì)胰腺癌患者血清外泌體脂質(zhì)進(jìn)行全面分析，鑒定出了37種脂質(zhì)成分在胰腺癌患者與健康對(duì)照者中有明顯差異。這些脂類與臨床病理特征有很強(qiáng)的相關(guān)性，提示外泌體脂質(zhì)可能是胰腺癌鑒別診斷的有效生物標(biāo)志物。關(guān)于脂質(zhì)在胰腺癌發(fā)生中的診斷作用研究很少，目前的研究證據(jù)尚不能對(duì)其診斷潛能加以評(píng)判。

3 總結(jié)與展望

胰腺癌作為一種高度惡性的腫瘤，死亡率極高，早期診斷是改善預(yù)后的關(guān)鍵，急需尋找有效的診斷標(biāo)志物。外泌體內(nèi)含有眾多的分子成分，且雙層膜結(jié)構(gòu)保證了其內(nèi)部信息的完整性，可確切反映親代細(xì)胞特征，并且廣泛存在于各種體液中，可無(wú)創(chuàng)、方便、實(shí)時(shí)地提取，具有成為腫瘤早期診斷標(biāo)志物的潛力?；谕饷隗w的液體活檢已成為早期診斷胰腺癌的一種有前途的工具，大量的研究已經(jīng)證明了外泌體對(duì)胰腺癌的診斷具有較高的敏感度和特異性。

然而，目前尚缺乏快速、經(jīng)濟(jì)、標(biāo)準(zhǔn)化的方案用于分離和提取外泌體及其內(nèi)容物，這些已知的診斷標(biāo)志物也需要進(jìn)一步的大規(guī)模臨床驗(yàn)證，目前還不能替代傳統(tǒng)檢查方法。雖然利用外泌體作為胰腺癌診斷工具的研究還處于初級(jí)階段，但目前的研究已讓我們看到外泌體在胰腺癌的診斷中有著十分廣闊的應(yīng)用前景。