淺析淋巴細(xì)胞亞群功能檢測技術(shù)

鄭金波

琿春礦業(yè)（集團(tuán)）有限責(zé)任公司總醫(yī)院，吉林琿春 133300

單獨(dú)測定淋巴細(xì)胞或其亞群的數(shù)量，常常不能反映淋巴細(xì)胞的功能。淋巴細(xì)胞功能試驗(yàn)則是檢查淋巴細(xì)胞（或某種亞群）在特異抗原刺激作用下分泌某種細(xì)胞因子或抗體（I g）的能力。檢測方法有以下幾種。

1 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（Euspot）法

用針對細(xì)胞因子如IFN、TNF、白細(xì)胞介素或免疫球蛋白的單克隆抗體包被Millipore Multiscreen 96孔濾膜板，加入待測PBMC（或純化的淋巴細(xì)胞亞群）及待研究的特異性抗原多肽共同溫育，當(dāng)PBMC（或純化的淋巴細(xì)胞亞群）中有能特異識別抗原多肽的細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞即可分泌某種細(xì)胞因子或某類I g。包被在膜上的單抗可捕獲相應(yīng)的細(xì)胞因子或I g。最后再加入酶標(biāo)記的抗相應(yīng)細(xì)胞因子或I g的抗體反應(yīng)，洗板后加入酶底物／色原呈色。以測定淋巴細(xì)胞分泌IFN-Y為例，簡述如下。

①抗人IFN-Y單克隆抗體（1 mg／mL）5 μL加10 mL pH7.4的無菌0.01 mol／LPBS，包被Millipore Multiscreen 96孔濾膜板，每100 μL，4℃過夜，用含熱滅活1%胎牛血清的PBS洗板，每孔加洗液200 μL，加入孔中吹吸后吸出，洗板6次。

②分別于每孔中加入含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)液30 μL，待研究的抗原肽10 μL和待測細(xì)胞100μL[（1～3）×106／mL。同時(shí)設(shè)陰性對照（含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)液）和陽性對照（加10 μL濃度為10 μL／mi的植物血凝素），于37℃ 5%CO2溫箱過夜。用PBS洗板6次。

③取出生物素化的抗人IFN-Y抗體加入10 μL無菌PBS中，振蕩混勻，每孔加入該溶液100 μL。于室溫（18～25℃）溫育1 h。用PBS洗板6次，拍干。

④取5 μL酶（ALP）標(biāo)記的鏈霉親合素，加入10 mL無菌PBS中振蕩混勻，每孔加入該溶液100 μL。于室溫溫育1 h。用PBS洗板6次，拍干。

⑤取10 μL Tris緩沖液（pH 9.5），依序分別加上述NBT和BCIP顯色試劑儲存液各L00 μL，振蕩混勻即為酶底物應(yīng)用液。取該溶液加入96孔濾膜板中，l00 μL／孔。置室溫溫育15～20 min，至出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)棄去板中液體。

⑥每孔加入0.05%Tween20的PBS200 μL。置室溫10 min，終止顯色反應(yīng)。棄去孔中液體，用流水沖洗3次，室溫晾干后，用ELlspot讀板儀讀取數(shù)據(jù)。

根據(jù)斑點(diǎn)形成的多少和大小判定淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（如IFN-Y）或I g的功能。每一個(gè)著色斑點(diǎn)代表一個(gè)獨(dú)立細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（如IFN-Y）的情況，斑點(diǎn)的數(shù)目代表抗原特異性淋巴細(xì)胞的數(shù)量，斑點(diǎn)的大小和染色程度則反映淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或I g的水平。

2 T淋巴細(xì)胞功能測定技術(shù)

2.1 T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

在體外培養(yǎng)的條件下，人類T細(xì)胞通過特定抗原（結(jié)核菌素）或非特定的有絲分裂原，如植物血凝素（PHA）后會(huì)發(fā)生刺激淋巴細(xì)胞增殖和成。3 h -胸腺嘧啶的參與可能發(fā)生淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)測定。細(xì)胞免疫功能低下者,T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低。刀豆蛋白A（ConA）是小鼠T細(xì)胞的馬仁特異性有絲分裂原。

2.2 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

器官移植前應(yīng)先受體和供體淋巴細(xì)胞混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來選擇一個(gè)合適的捐贈(zèng)者。方法和單向法雙向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)點(diǎn)。雙向法兩個(gè)人一起混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),如果不同HLA分子，兩個(gè)來源的淋巴細(xì)胞刺激將被改造。根據(jù)程度的轉(zhuǎn)換來確定兩個(gè)人不同程度的淋巴細(xì)胞HLA分子。同卵雙胞胎之間的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后不發(fā)生轉(zhuǎn)換。單向法將單個(gè)淋巴細(xì)胞治療與絲裂霉素或輻射失去自己的能力，但一直有著這樣的抗原性，淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，未經(jīng)處理的另一個(gè)個(gè)體。根據(jù)程度的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化治療來確定兩個(gè)人淋巴細(xì)胞HLA分子不同的程度?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化均可發(fā)生。

2.3 延遲超敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)

已知數(shù)量的抗原（如結(jié)核菌純蛋白衍生物）注入到前臂皮膚，24～48 h后測定硬化＞硬結(jié)尺寸，直徑10 mm，被認(rèn)為是陽性的。皮膚測試負(fù)可能有細(xì)胞免疫功能低下，不能接觸與相應(yīng)的抗原。

2.4 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

用效應(yīng)性CTI和51cr標(biāo)記的靶細(xì)胞相互作用。被殺死靶細(xì)胞可以釋放51cr、確定目標(biāo)細(xì)胞的放射性釋放51cr、可以確定效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的影響的CTL。使用類似的方法還可以確定細(xì)胞毒性NK細(xì)胞活性。

3 B淋巴細(xì)胞功能檢測

①B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的淋巴細(xì)胞和不溶性金黃色葡萄球菌（B淋巴細(xì)胞分裂原），連同3 h -胸腺嘧啶參與實(shí)驗(yàn)可以測定B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換發(fā)生。細(xì)菌脂多糖在小鼠B細(xì)咆分裂原。

②測定抗體生成細(xì)胞常用的溶血空斑試驗(yàn)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，抗體生成細(xì)胞分泌I g與綿羊紅細(xì)胞（生成）表面的抗原，補(bǔ)充溶血性反應(yīng)參與。方法是吸附有已知的抗原生成，等待檢驗(yàn)的B淋巴細(xì)胞，補(bǔ)充和瓊主旨糖的混合物，傾注平皿和1～3 h后，驅(qū)散肉眼可見的溶血牙菌斑和每個(gè)空點(diǎn)中央含有抗體形成細(xì)胞的數(shù)量、斑塊是抗體形成細(xì)胞數(shù)。是NK細(xì)胞功能的檢測。

目前國內(nèi)外多采用檢測NK細(xì)胞活性來研究不同疾病狀態(tài)下NK細(xì)胞的殺傷功能。體外NK細(xì)胞活性測定的方法較多，常用的有流式細(xì)胞術(shù)、形態(tài)學(xué)方法、放射性同位素釋放法、酶釋放法、特異性熒光染料釋放法等。本節(jié)僅介紹流式細(xì)胞儀測定NK細(xì)胞功能。

NK細(xì)胞活性是一種細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，它無須特異性抗體參與，也無MHC限制性，不經(jīng)抗原活化即能直接殺傷靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)選用K562細(xì)胞為測定人NK細(xì)胞活性的靶細(xì)胞，利用碘化丙啶染料排斥法，這種染料具有只滲透到死亡細(xì)胞內(nèi)的特點(diǎn)，用流式細(xì)胞儀檢測靶細(xì)胞受NK細(xì)胞作用后的死亡率來反映NK細(xì)胞的活性。

①肝素抗凝血2 mL，如等量生理鹽水稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液按常規(guī)法分離出淋巴細(xì)胞。

②用0.01 mol／LpH7.4PBS洗滌分離的淋巴細(xì)胞2次，每次1000 r／min，離心5 min。計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，作為效應(yīng)細(xì)胞。

③取培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMll640培養(yǎng)液中處于指數(shù)生長期的K562靶細(xì)胞，用上述培養(yǎng)液洗滌2次、計(jì)數(shù)、備用。

④按效應(yīng)細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）：靶細(xì)胞為20：1的比例取細(xì)胞混勻于200 μL 10%小牛血清的RPMI l640培養(yǎng)液中。另設(shè)單純K562細(xì)胞自然死亡對照組，低速離心000r／min，1 min后，置37℃溫箱，作用2 h，置4℃冰箱，加入碘化丙碇（pI，501μg／mL）1 mL到上述試管中，1～2 h上流式細(xì)胞測定NK細(xì)胞活性。

⑤流式細(xì)胞儀測定：按儀器操作說明書進(jìn)行，以PI染每。的K562細(xì)胞為死細(xì)胞，NK細(xì)胞活性則以靶細(xì)胞死亡率為指標(biāo)。

檢測T、B和NK細(xì)胞主要是用免疫學(xué)技術(shù)測定它們的表面標(biāo)志物，如T細(xì)胞主要測定細(xì)胞膜上的分化抗原群（cluster of differentiation，CD）CD3、CD4、CD8。其中，CD3是所有T細(xì)胞的特有標(biāo)志，CD4是輔助性T細(xì)胞（TH）的標(biāo)志，CD8是細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）的標(biāo)志。B細(xì)胞的表面標(biāo)志主要是膜免疫球蛋白或表面免疫球蛋白IgM、IgD以及CD抗原CDl9、CD20、CD22。NK細(xì)胞特異表面標(biāo)志主要為CD56和CDl6。

[1] 黃曉群.聯(lián)合檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群及血清CEA在大腸癌患者中的表達(dá)意義[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，6（12）：996.

[2] 王立芳，許惠玉，張威.免疫熒光技術(shù)和免疫酶標(biāo)法在T淋巴細(xì)胞亞群檢測中的應(yīng)用體會(huì)[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25（3）：292.