低頻超聲與抗菌藥物協(xié)同增效研究進(jìn)展

劉 旭，蔡 蕓，白 艷，朱亞萍，王 睿（解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京 100853）

低頻超聲是指超聲頻率范圍在20 KHz ～ 1 MHz的聲波。1994年，Qian等發(fā)現(xiàn)并將低頻超聲與抗菌藥物的協(xié)同作用定義為聲學(xué)生物效應(yīng)（bioacoustic effect）[1]。近年來，低頻超聲技術(shù)發(fā)展迅速并在醫(yī)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用，可用于止痛、脫敏、溶栓、預(yù)防免疫缺陷、腫瘤治療等[2]。無論是對浮游態(tài)的細(xì)菌還是已形成生物被膜的細(xì)菌，低頻超聲都可增強抗菌藥物的抗菌能力[3]。目前，在低頻超聲與抗菌藥物協(xié)同增效方面，相關(guān)研究仍處于初步發(fā)展階段，主要用于體外與動物實驗中，人體的試驗則大多為治療局部感染。本文針對近年來低頻超聲與抗菌藥物協(xié)同增效的機制及其在浮游態(tài)細(xì)菌、細(xì)菌生物被膜感染（例如慢性創(chuàng)傷、植入假體的感染）、基因轉(zhuǎn)染這幾個方面的應(yīng)用做一綜述，以期為臨床上應(yīng)用低頻超聲聯(lián)合抗菌藥物治療細(xì)菌感染提供參考。

1 低頻超聲的抗菌機制

低頻超聲的生物學(xué)效應(yīng)主要包括機械效應(yīng)、熱效應(yīng)、空化效應(yīng)及化學(xué)效應(yīng)等，其中，最主要的機制是空化效應(yīng)[1,3]。空化效應(yīng)是指周期性變化的高、低聲壓導(dǎo)致液體中微泡的周期性膨脹和壓縮。眾多研究指出，由于空化效應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性增加，從而提高抗菌藥物的穿透能力，增強抗菌效果。空化效應(yīng)分為瞬間空化效應(yīng)和穩(wěn)態(tài)空化效應(yīng)。穩(wěn)態(tài)空化效應(yīng)產(chǎn)生微泡在壓縮階段體積逐漸縮小，并保持其穩(wěn)定狀態(tài)，增加微泡數(shù)量和振動幅度均可增強層流效果，加速液體中物質(zhì)的運輸，故當(dāng)穩(wěn)態(tài)空化效應(yīng)發(fā)揮作用時，低頻超聲與抗菌藥物的協(xié)同作用具有濃度依賴性。提高超聲頻率，抗菌藥物的抗菌增效能力減弱；提高超聲強度，該效力則增強，這符合穩(wěn)態(tài)空化效應(yīng)的機制[4]。

化學(xué)效應(yīng)是許多化學(xué)物質(zhì)經(jīng)水解、分解或聚合改變自身結(jié)構(gòu)的效應(yīng)[5]，可能是由于低頻超聲時產(chǎn)生的自由基發(fā)揮作用，它攻擊細(xì)菌細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜的滲透性，從而增強抗菌藥物的抗菌作用[6-7]。

目前，低頻超聲對抗菌藥物的協(xié)同效應(yīng)，可能由以上一種或幾種機制共同作用所致，但具體到某種抗菌藥物和特定的細(xì)菌，確切的機制還有待研究。

2 低頻超聲對浮游態(tài)細(xì)菌的抗菌增效作用

低頻超聲聯(lián)合抗菌藥物對浮游態(tài)細(xì)菌可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，可能是由于低頻超聲作用下，產(chǎn)生空化效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)，破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜所致。

細(xì)菌對低頻超聲來說幾乎是透明的，即超聲波在經(jīng)過細(xì)菌細(xì)胞時幾乎沒有吸收、分散或其他的作用。Pitt等[8]發(fā)現(xiàn)，低頻超聲（頻率67 KHz，強度0.3 W·cm-2）單獨作用時對細(xì)菌沒有明顯影響，但聯(lián)合慶大霉素類藥物時，可以增強慶大霉素對浮游態(tài)的銅綠假單胞菌和大腸桿菌的抑菌和殺菌作用，卻對革蘭陽性的表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌作用不大，并且將懸濁菌液經(jīng)超聲輻照之后再加入抗菌藥物，抗菌效力卻未能增強；結(jié)果提示：對于不同種類的細(xì)菌，其協(xié)同效應(yīng)不盡相同，且低頻超聲對細(xì)菌耐藥性的影響可能是暫時性的。對此，有人提出“聲孔效應(yīng)”，這是由于空化效應(yīng)產(chǎn)生的沖擊波、微射流對細(xì)胞膜作用的結(jié)果，在這種作用下，細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆的孔，這種“臨時通道”導(dǎo)致抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部的量增多，最終增強抗菌藥物的抗菌作用[4]。Williams等[9]以慶大霉素聯(lián)合低頻超聲（頻率70 KHz，強度由4.5 mW·cm-2增加到10 mW·cm-2）對浮游態(tài)大腸桿菌作用，觀察到隨著強度增加，細(xì)菌的數(shù)量降低。這符合穩(wěn)態(tài)空化效應(yīng)作用，改變細(xì)菌細(xì)胞膜而使抗菌藥物更加容易進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部[10]。Liu等[6]以低頻超聲（頻率40 KHz，強度1 W·cm-2）聯(lián)合氟喹諾酮類藥物對大腸桿菌作用時，產(chǎn)生微泡破裂首先造成大腸桿菌細(xì)胞壁的局部損傷，而經(jīng)化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生·OH 和·O2-自由基攻擊細(xì)菌的表面及內(nèi)部，進(jìn)一步損傷細(xì)菌。Zhang等[6-7]認(rèn)為化學(xué)效應(yīng)是低頻超聲提高氟喹諾酮類藥物抗菌效果的主要機制。在細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染研究中，Yurika[11]等在體外實驗研究衣原體感染Hela細(xì)胞時，超聲（1.011 MHz，強度0.44 W·cm-2，0.15 W·cm-2，25%占空比，20 s）單獨作用，細(xì)菌數(shù)量沒有很大變化。當(dāng)聯(lián)合多西環(huán)素（濃度為0.5倍MIC）作用時，強度在0.15 W·cm-2和0.44 W·cm-2時，細(xì)菌IFUs分別降低至（66±39）%和（15±12）%。作者認(rèn)為其機制為空化效應(yīng)作用下增強抗菌藥物在細(xì)胞中的傳遞。He等[12]認(rèn)為細(xì)胞表面由于空化效應(yīng)、高壓等因素而增強了細(xì)胞膜的滲透性，提高抗菌藥物對生物被膜的穿透能力，使抗菌效果增強。

3 低頻超聲在細(xì)菌生物被膜感染中的應(yīng)用

目前，治療生物被膜感染十分棘手，細(xì)菌生物被膜的生物學(xué)特性與浮游菌不同，由于細(xì)菌分泌糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等將其自身包圍其中的膜樣結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其環(huán)境適應(yīng)能力更強，可抵抗吞噬細(xì)胞作用，逃避宿主免疫，耐藥性極強，可達(dá)到浮游狀態(tài)的10 ～ 1000倍，所致感染難以清除[13]。

低頻超聲聯(lián)合抗菌藥物對已形成生物被膜的細(xì)菌同樣具有協(xié)同效應(yīng)，但這種協(xié)同效應(yīng)受很多因素的影響，如頻率、時間、溫度、pH等，對不同的菌種其效果也不盡相同。He等[4]使用超聲靶向微泡破碎（頻率0.08 MHz，強度1.0 W·cm-2，50%占空比，37℃，超聲12 h）聯(lián)合萬古霉素共同作用于表皮葡萄球菌RP62A的生物被膜上，治療后細(xì)菌數(shù)目明顯下降。Rediske等[3]將培養(yǎng)的大腸桿菌（ATCC 10798）生物被膜埋置于新西蘭白兔體內(nèi)，以28.48 KHz，100 ～ 300 mW·cm-2強度進(jìn)行24 h超聲，結(jié)果只有當(dāng)強度為300 mW·cm-2時，細(xì)菌數(shù)目發(fā)生明顯下降。但應(yīng)注意300 mW·cm-2的強度對人體皮膚有損害。Carmen等[14]發(fā)現(xiàn)低頻超聲（頻率28.5 KHz，強度500 mW·cm-2，占空比1∶3，時間48 h）聯(lián)合慶大霉素對于大腸桿菌生物被膜作用明顯，而對銅綠假單胞菌生物被膜沒有明顯作用。低頻超聲增強抗菌藥物對生物被膜的作用機制可能是由于空化效應(yīng)破壞生物被膜而使抗菌藥物穿過生物被膜的量增加所致[15-16]。有研究[17]使用低頻超聲（頻率28.48 KHz，強度500 mW·cm-2，1∶3占空比）聯(lián)合萬古霉素，與單獨應(yīng)用萬古霉素相比，在48 h其細(xì)菌數(shù)目減少了2.08 log10 cfu·cm-2（P= 0.01，n= 3），認(rèn)為超聲增強抗菌藥物的作用，其機制可能是低頻超聲產(chǎn)生高壓，高剪切力或是空化作用導(dǎo)致細(xì)胞膜和生物被膜被破壞。但也有研究稱抗菌藥物的低擴散性并非生物膜耐藥性高的主要因素[18]，超聲促進(jìn)氧分子和營養(yǎng)物質(zhì)穿過生物膜，同時加快細(xì)菌代謝產(chǎn)物排出，使“饑餓”狀態(tài)的細(xì)菌得到必要的氧分子和營養(yǎng)物質(zhì)，低代謝細(xì)菌從“冬眠”中復(fù)蘇，恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性。這種機制可能起到更加重要的作用[4]。Qian等[1]以低頻超聲（頻率500 KHz，強度10 W·cm-2，時間2 h）單獨作用于銅綠假單胞菌生物被膜，用激光共聚焦顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)其生物被膜結(jié)構(gòu)并無發(fā)生明顯變化，聯(lián)合慶大霉素后，生物被膜細(xì)菌活性較單獨應(yīng)用慶大霉素時低，而這可能是由于聲孔效應(yīng)發(fā)生于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部，但這方面需要進(jìn)一步的研究。

3.1 低頻超聲在慢性創(chuàng)傷感染中的作用

60%以上的慢性創(chuàng)面可以檢測到細(xì)菌生物被膜[19]。傷口中的細(xì)菌能夠推遲或阻止傷口愈合，而生物被膜形成使其耐藥性更強。近年來，低頻超聲技術(shù)對于慢性傷口，如糖尿病足、靜脈性潰瘍、動脈性或缺血性潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、褥瘡及有狹長瘺道的傷口等應(yīng)用愈加廣泛[2]。目前，低頻超聲作為一種替代療法，用于多重耐藥菌感染的慢性創(chuàng)傷病人。這可能與低頻超聲破壞了細(xì)菌與壞死組織形成的生物膜，進(jìn)而破壞了細(xì)菌的保護(hù)機制有關(guān)。也可能因為低頻超聲產(chǎn)生空化效應(yīng)，在細(xì)菌的細(xì)胞膜上“打孔”，導(dǎo)致細(xì)菌對于抗菌藥物的吸收增多，最終達(dá)到更有效殺菌的目的[4]。

慢性鼻竇炎是一種常見的炎癥疾病，鼻竇炎與鼻息肉被認(rèn)為是一種免疫疾病，其影響因素很多，如免疫系統(tǒng)紊亂、環(huán)境因素、真菌、細(xì)菌生物被膜等。Tamas Karosi[20]應(yīng)用低頻超聲（0.4 MHz，0.5 W·cm-2，5 min）治療慢性鼻竇炎的體外實驗中發(fā)現(xiàn)，在鼻息肉上皮下層，炎癥細(xì)胞計數(shù)明顯下降，在上皮細(xì)胞層的表面，細(xì)菌生物被膜則被完全除去。目前，美國、俄羅斯、新西蘭、伊朗都有使用低頻率脈沖超聲治療慢性鼻竇炎有效的報道。早期研究中的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)表明其作用機制可能是提高細(xì)菌的代謝速率，增強對局部抗菌藥物的敏感性及改變細(xì)菌滲透性[21]。此外，Julia Escandon等[22]在治療腿部靜脈炎研究中也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量的減少，但并不明顯。糖尿病足是糖尿病控制不良導(dǎo)致機體免疫力降低而發(fā)生的足部感染，常見致病菌大多為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌等[23-24]。因免疫力低，糖尿病足不易治愈，嚴(yán)重者發(fā)生壞疽，甚至截肢。一位患有Ⅱ型糖尿病、冠狀動脈疾病及外周血管疾病的72歲老年病人，其足部潰爛，經(jīng)檢查其傷口有葡萄球菌（4+），嗜麥芽窄食單胞菌（4+），棒狀桿菌屬（4+），應(yīng)用25 KHz超聲治療，再應(yīng)用抗菌藥物，經(jīng)過8周治療后，其壞死組織清理完畢，之前暴露的骨頭現(xiàn)在被肉芽組織覆蓋，再次檢查傷口發(fā)現(xiàn)MRSA（2+），其傷口的愈合良好[25]。

3.2 低頻超聲在植入假體感染中的應(yīng)用

一些植入假體成為了細(xì)菌的聚集地，其感染途徑很多，如外科手術(shù)時皮膚上的細(xì)菌沿著導(dǎo)尿管表面進(jìn)入體內(nèi)而造成感染[26]，目前清除感染最徹底的方法是更換植入假體，而這種方法需要病人耗費大量金錢，并且忍受極大痛苦。目前，沒有非侵入性的有效方法能夠治療植入假體的生物被膜感染[27]。

最常用的是將抗菌藥物置于植入假體材料中來殺死細(xì)菌。自1970年Buchholz等[26]首次將抗菌藥物加載在骨水泥上，嘗試應(yīng)用于控制關(guān)節(jié)感染以來，人們開始認(rèn)識到這種局部給藥的優(yōu)點。但其抗菌藥物濃度下降快且只有20%能夠有效的釋放應(yīng)用[9]。Ensing等研究低脈沖超聲（28.48 KHz，500 mW·cm-2）聯(lián)合載有慶大霉素骨水泥時發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌生物被膜活性明顯降低[27]。其機制為低頻超聲在增加抗菌藥物釋放的同時，憑借空化效應(yīng)，能促進(jìn)分子穿透多種生物被膜[5]，實現(xiàn)藥物的靶向釋放，并增強已釋放抗菌藥物的抗菌能力[29]。

4 低頻超聲通過影響基因表達(dá)改變細(xì)菌耐藥性

低頻超聲可能影響細(xì)胞基因表達(dá)和細(xì)胞器的生物活性，促進(jìn)抗菌藥物與靶點結(jié)合，影響耐藥相關(guān)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成，并由此改變細(xì)菌生長速率和耐藥性能等生物學(xué)活性[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌形成生物被膜后可高表達(dá)外排泵基因PA1874-1877，而將該組基因刪除后，細(xì)菌耐藥性明顯下降[4]。

低頻超聲在基因轉(zhuǎn)染上很有優(yōu)勢，其機制可能為空化效應(yīng)，振動微泡周圍產(chǎn)生的局部熱效應(yīng)加快了細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)速度[5]，也可能為“聲孔效應(yīng)”所致[30]。 Song[31]等運用40 KHz低頻超聲成功地將質(zhì)粒pBBR1MCS2高效率導(dǎo)入惡臭假單胞菌UWC1、大腸桿菌DH5a及熒光假單胞菌SBW25，并發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞膜上產(chǎn)生了可逆的孔。超聲可以促進(jìn)真核細(xì)胞的基因或藥物傳遞[32]，由電鏡掃描得出其機制可能同樣為“聲孔效應(yīng)”。然而，細(xì)菌要比真核細(xì)胞小的多，也擁有更加強韌的細(xì)胞壁，所以對于細(xì)菌的超聲作用機制需更深入的研究[4]。此外，有研究稱調(diào)控基因或sRNA傳遞能夠作用于細(xì)菌沉默基因而改變其行為，sRNA和調(diào)控基因有可能被使用成為新型抗菌藥物來對抗多重耐藥細(xì)菌，或是抑制細(xì)菌生物被膜的形成[33]。

超聲治療是一種無創(chuàng)的治療方法，損傷小并可進(jìn)行靶向治療。其次，超聲在臨床上應(yīng)用廣泛，而抗菌藥物也已有幾十年的使用歷史，低頻超聲與抗菌藥物聯(lián)合的治療方法，病人容易接受。第三，應(yīng)用超聲治療，費用較低。但目前低頻超聲與抗菌藥物協(xié)同增效的研究還處于初步階段，存在許多問題需要解決，如頻率、強度、時間、溫度等參數(shù)上的選擇，對不同藥物、不同菌種，其作用機制也不盡相同。又比如空化效應(yīng)作用于細(xì)菌細(xì)胞膜或細(xì)菌生物被膜，使其滲透性增加，可抗菌藥物是通過何種機制進(jìn)入細(xì)胞膜和生物被膜內(nèi)發(fā)揮作用的并不清楚。低頻超聲技術(shù)聯(lián)合抗菌藥物的方法如需廣泛應(yīng)用于臨床，還有待進(jìn)一步研究。

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