伏立康唑片在中國健康男性體內(nèi)的生物等效性研究

邱學(xué)文，楊 波，向榮鳳，戴 青，熊麗蓉，歐陽凈，蔡永青，劉 芳，王顯鳳，陳勇川（重慶市西南醫(yī)院藥劑科，重慶400038）

伏立康唑（voriconazole）是第二代三唑類抗真菌藥，為氟康唑的衍生物，具有抗菌譜廣、生物利用度高、安全且可通過血腦屏障等特點(diǎn)。臨床上主要用于治療急性或慢性深部真菌感染、侵襲性去霉菌病、新型隱球菌性腦膜炎，對氟康唑耐藥的嚴(yán)重侵入性念珠菌病感染（包括克魯斯念珠菌）以及由足放線菌屬和鐮刀菌屬引起的嚴(yán)重真菌感染[1-3]，還可以用于預(yù)防侵入性真菌感染免疫功能低下的患者[4-5]。伏立康唑的抗菌機(jī)制為抑制真菌細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的14α-甾醇的去甲基作用，從而抑制真菌麥角甾醇的合成，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜合成不足[6-7]。

伏立康唑口服吸收迅速，達(dá)峰時(shí)間為1 ～ 2 h，生物利用度96%，食物可影響其吸收，在餐前1 h或餐后2 h服用，藥物的吸收增加。體內(nèi)代謝呈非線性藥動學(xué)特性，即本品藥動學(xué)的個體差異很大。隨給藥劑量增加，藥物曲線下面積（AUC）成比例增加，但在兒童體內(nèi)，伏立康唑代謝表現(xiàn)為線性藥動學(xué)特性，即如果要達(dá)到相同的藥物濃度，需服用較高劑量[8]。伏立康唑主要在肝臟通過細(xì)胞色素P450同工酶CYP2C19進(jìn)行代謝。代謝物主要經(jīng)尿液排泄，小于5%的藥物以原型隨尿液排出。伏立康唑的蛋白結(jié)合率約為58%，肝腎功能不全對伏立康唑的蛋白結(jié)合率無影響[8]。本試驗(yàn)主要研究國產(chǎn)伏立康唑片與進(jìn)口伏立康唑片在中國健康成年男性志愿者中的藥動學(xué)參數(shù)和相對生物利用度，以評價(jià)兩者的生物等效性，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

液相色譜系統(tǒng)包括紫外檢測器，四元輸液泵，自動進(jìn)樣器，切換閥及數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)（美國Agilent公司）；高速離心機(jī)（美國Abbott公司）；超純水器（MiLLi-Q plus，USA，MiLLipore公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；振蕩器（IKA-VORTEX）。

伏立康唑?qū)φ掌罚ㄅ枺?00862-200701，中國藥品生物制品檢定所）；卡馬西平對照品（內(nèi)標(biāo)，批號：100142-201004，中國藥品生物制品檢定所）；受試制劑：伏立康唑片（200 mg/片，批號：100302，成都華神集團(tuán)股份有限公司制藥廠）；參比制劑：伏立康唑片（200 mg/片，批號：B10002040，美國輝瑞公司）；甲醇、乙腈為色譜純；三乙胺（分析純，成都化學(xué)試劑廠）；冰醋酸（分析純，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司）；空白血漿由西南醫(yī)院血庫提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相為乙腈-水-冰醋酸-三乙胺 = 42∶58∶0.1∶0.05；流速：1.4 mL·min-1；檢測波長：256 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 受試者選擇

健康男性志愿者20名，試驗(yàn)過程中1名受試者主動退出，共19名受試者完成此次試驗(yàn)。受試者年齡（22.6±2.3）歲，身高（170.8±4.7） cm，體重（58.1±10.6） kg，試驗(yàn)前進(jìn)行體格檢查，血尿常規(guī)、肝腎功能、心率、血壓和心電圖等檢查均正常；試驗(yàn)者既往體健，無藥物過敏史，無吸煙、嗜酒及經(jīng)常用藥史。2周內(nèi)未服用任何可能影響本品吸收、代謝的藥物。試驗(yàn)期間統(tǒng)一清淡飲食，不使用除受試制劑和參比制劑以外的任何藥物，不接受煙、酒及含咖啡的飲料，避免劇烈運(yùn)動。受試者試驗(yàn)前簽署知情同意書，本試驗(yàn)方案經(jīng)重慶西南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

2.3 試驗(yàn)方案

參照《化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，采用雙周期自身隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組受試者每次試驗(yàn)時(shí)分別服用伏立康唑片受試制劑或參比制劑。受試者于試驗(yàn)前1 d晚餐后，禁食不禁水12 h，次日清晨空腹分別單劑量口服含伏立康唑200 mg的受試制劑或參比制劑，以200 mL溫開水送服，并作記錄。服藥2 h后可自由飲水，服藥4 h后進(jìn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。試驗(yàn)期間由醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行監(jiān)護(hù)。間隔7 d后交叉給藥，重復(fù)上述試驗(yàn)。分別于服藥前0 h和服藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 h由前臂肘靜脈取血4 mL。血樣置于肝素化的離心管中，3000 r·min-1離心5 min，分離出血漿，置- 30 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?0.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度獲得濃度為1 mg·mL-1的儲備液，- 30 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。精密稱取卡馬西平對照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度獲得濃度為1 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備液，在- 30 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，用時(shí)配成20 μg·mL-1工作液。

2.5 血漿樣品處理

取待測血漿0.8 mL，加入20 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg·mL-1），混勻30 s，再加入100 μL 1.0 mol·L-1NaOH，混勻30 s，再加入3.2 mL乙酸乙酯：正己烷（4∶1），混勻3 min，3000 r·min-1離心5 min，取上層有機(jī)相于60 ℃水浴N2吹干，殘?jiān)?00 μL流動相溶解，混勻1 min，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2.6 專屬性考察

分別取6份來自不同個體的空白血漿0.8 mL，除不加標(biāo)準(zhǔn)溶液外，其余按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)行HPLC分析得空白血漿樣品的色譜圖1A，將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中，同法操作得相應(yīng)的色譜圖1B，結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾伏立康唑和卡馬西平的測定。

圖1 典型的高效液相色譜圖

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取7份空白血漿，加入伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg·mL-1）適量，使?jié)舛葹?0 μg·mL-1，再依次用空白血漿稀釋成2000，1000，500，200，100，50，20 ng·mL-1，按上述樣品處理方法操作，記錄色譜圖。以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，得直線回歸方程y= 0.670 1x- 0.000 9，r＝0.999 8，表明本方法在20 ～ 2000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本方法最低定量限20 ng·mL-1。

2.8 精密度與回收率實(shí)驗(yàn)

按“標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限”項(xiàng)下的方法配制低（50 ng·mL-1）、中（200 ng·mL-1）、高（1600 ng·mL-1）三個濃度的伏立康唑樣品，按樣品處理方法處理，在一日內(nèi)每一濃度進(jìn)行5樣本分析，計(jì)算本法的日內(nèi)精密度與相對回收率；同時(shí)，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測定3 d，計(jì)算本法的日間精密度；根據(jù)血漿中伏立康唑、卡馬西平的峰面積與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣測得的伏立康唑、卡馬西平的峰面積之比計(jì)算其絕對回收率。具體結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery test

2.9 數(shù)據(jù)處理

受試制劑與參比制劑的Cmax和tmax均以實(shí)測值表示；AUC0-t以梯形法計(jì)算；AUC0-∞按公式計(jì)算：AUC0-∞= AUC0-t+Ct/λz（t為最后一次可實(shí)測血藥濃度的采樣時(shí)間；Ct為末次可測樣本藥物濃度；λz為對數(shù)藥-時(shí)曲線末端直線部分求得的末端消除速率常數(shù)）；t1/2= 0.693/λz。以各個受試者服用受試制劑與參比制劑的AUC0-t分別計(jì)算其相對生物利用度，F(xiàn)=AUC受試制劑/AUC參比制劑×100%。主要藥動學(xué)參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后以多因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，然后用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和計(jì)算90%置信區(qū)間的統(tǒng)計(jì)分析方法來評價(jià)和判斷藥物間的生物等效性。藥動學(xué)基本參數(shù)的計(jì)算與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析借助DAS Ver 3.0軟件完成。

2.10 血藥濃度測定結(jié)果及藥動學(xué)參數(shù)

19名受試者口服伏立康唑片受試制劑或參比制劑200 mg后的平均藥-時(shí)曲線見圖2，主要藥動學(xué)參數(shù)見表2。對同一受試者服用兩種制劑的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。以參比制劑為對照，受試制劑的相對生物利用度為（100.5±3.4）%。

圖2 19名健康志愿者單劑量口服伏立康唑片受試制劑或參比制劑后的平均藥-時(shí)曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of voriconazole in 19 healthy volunteers after single oral dose of voriconazole tablets

2.11 生物等效性評價(jià)

受試制劑和參比制劑的Cmax、AUC經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，并進(jìn)一步采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和（1-2α）置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評價(jià)，tmax采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。伏立康唑的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax均拒絕生物不等效假設(shè)（P＞ 0.05）；受試制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的73.7% ～ 109.5%、92.4% ～ 116.5%和93.3% ～ 115.6%；非參數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種制劑的tmax差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。以上結(jié)果表明兩種制劑具有生物等效性。

表2 19名健康志愿者單劑量口服伏立康唑片受試制劑或參比制劑后的主要藥動學(xué)參數(shù)Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of voriconazole in 19 healthy volunteers after single oral dose of voriconazole tablets

2.12 不良事件

整個試驗(yàn)過程由經(jīng)《藥物臨床試驗(yàn)管理規(guī)范》（GCP）培訓(xùn)的臨床醫(yī)師和護(hù)士進(jìn)行觀察，19名受試者在服用含伏立康唑200 mg的受試制劑或參比制劑后均無不適主訴，亦未觀察到不良事件。

3 討論

本試驗(yàn)中，19例健康男性受試者雙周期隨機(jī)交叉單劑量口服試驗(yàn)制劑和參比制劑, 服藥劑量均為200 mg。試驗(yàn)結(jié)果表明,口服給藥后，試驗(yàn)制劑和參比制劑在健康志愿者的體內(nèi)過程非常接近，主要藥動學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），單次口服試驗(yàn)制劑的伏立康唑片平均相對生物利用度為（102.9±15.3）%，雙單側(cè)t檢驗(yàn)和（1-2α）置信區(qū)間檢驗(yàn)表明兩種制劑具有生物等效性。

本次研究結(jié)果與高洪志等[9]的研究比較，參比試劑和受試制劑的達(dá)峰時(shí)間tmax和半衰期值相近，Cmax和AUC0-∞相差約1.7倍。分析差異的原因可能是由于本次研究的受試者年齡為（22.6±2.3）歲，而高洪志等研究中受試人群相比年齡較小，故受試者代謝快，Cmax和AUC0-∞較??；另外，高洪志等的研究采用的是中國北方的受試者，而本次研究招募的是西南地區(qū)的受試者，地域分布的原因也可能使Cmax和AUC0-∞較小。Driscoll等[10]研究發(fā)現(xiàn)青少年人群達(dá)到成年人群相同藥物濃度需給予更大的伏立康唑劑量。由于該試驗(yàn)的研究對象均為健康男性，且為單劑量給藥，人群范圍窄，年齡均較年輕化，故結(jié)果不能代表或推斷出兒童、老年人群的給藥指數(shù)。如進(jìn)一步確認(rèn)國內(nèi)人群伏立康唑藥動學(xué)參數(shù)的差異，需增加受試者的病例數(shù)，并且考察伏立康唑代謝酶基因型分布及多態(tài)性對伏立康唑代謝的影響。

在整個試驗(yàn)過程中，由負(fù)責(zé)醫(yī)生于給藥前及給藥后24 h測量受試者的血壓、體溫、呼吸、脈博，并在試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行血液生化、血常規(guī)及尿常規(guī)檢查，結(jié)果受試者無不良反應(yīng)發(fā)生，檢查指標(biāo)未見異常，表明試驗(yàn)藥物在試驗(yàn)劑量下具有較好的安全性。

[1] Walsh TJ, Anaissie EJ, Denning DW,et al. Treatment of aspergillosis: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America[J]. Clin Infect Dis, 2008, 46(3): 327-360.

[2] Pappas PG, Kauffman CA, Andes D,et al. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America[J]. Clin Infect Dis, 2009,48(5): 503-535.

[3] Lortholary O, Obenga G, Biswas P,et al. International retrospective analysis of 73 cases of invasive fusariosis treated with voriconazole[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010,54(10): 4446-4450.

[4] Marks DI, Pagliuca A, Kibbler CC,et al. Voriconazole versus itraconazole for antifungal prophylaxis following allogeneic haematopoietic stem-cell transplantation[J]. Br J Haematol, 2011,155(3): 318-327.

[5] Wingard JR, Carter SL, Walsh TJ,et al. Randomized, doubleblind trial of fluconazole versus voriconazole for prevention of invasive fungal infection after allogeneic hematopoietic cell transplantation[J]. Blood, 2010, 116(24): 5111-5118.

[6] 申蘭慧，石濤，張巖，等. 新一代廣譜抗真菌藥伏立康唑[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，23（1）：62-67.

[7] 沈銀忠. 伏立康唑的臨床合理應(yīng)用[J]. 世界臨床藥物，2009，30（12）：715-720.

[8] Leveque D, Nivoix Y, Jehl F,et al. Clinical pharmacokinetics of voriconazole[J]. Int J Antimicrob Agents, 2006, 27(4): 274-284.

[9] 高洪志，梁宇光，林麗娜，等. 2種伏立康唑片劑的人體生物等效性研究[J]. 中國新藥雜志，2007，16（14）：1133-1136.

[10] Driscoll TA, Yu LC, Frangoul H,et al. Comparison of pharmacokinetics and safety of voriconazole intravenous-to-oral switch in immunocompromised children and healthy adults[J].Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(12): 5770-5779.