骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠佐劑性關節(jié)炎防治的實驗研究＊

許鍵煒，申長清，趙芳芳，舒莉萍，何志旭△

（1.貴陽醫(yī)學院藥理學教研室 550004；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，山東濟寧 272029；3.蚌埠醫(yī)學院微生物學教研室，安徽蚌埠 233030；4.貴陽醫(yī)學院組織工程與干細胞實驗中心 550004）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類以關節(jié)滑膜炎及對稱性、破壞性的關節(jié)病變?yōu)橹饕卣鞯穆匀硇宰陨砻庖咝约膊。?］。RA在人群中的發(fā)病率約為0.24%～1.00%。其發(fā)病機制尚不十分明確。傳統(tǒng)治療方法以藥物治療為主，但僅能使患者的病情得到部分緩解，尚不能有效地逆轉(zhuǎn)RA發(fā)生的病理生理改變。目前研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，能抗炎、抗纖維化及促進血管形成、修復受損組織［2］。分離、培養(yǎng)以及擴增MSCs簡便、經(jīng)濟，可獲取較多量的 MSCs。采用弗氏完全佐劑建立與人類RA類似的大鼠佐劑性關節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）模型［3］，方法成熟、簡便。本研究采用MSCs治療佐劑性關節(jié)炎大鼠模型，修復病損組織，達到治療、干預AA的目的。為臨床RA的防治提供實驗理論基礎，探索新的出路。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠（貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供），低糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），0.25%胰蛋白酶及10%胎牛血清（美國Hyclone公司），弗氏完全佐劑（美國Sigma公司），倒置相差顯微鏡（日本Panasonic公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma公司），流式細胞儀（FACS AriaⅡ，美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 MSCs的體外分離、純化、增殖培養(yǎng)、鑒定及收集 取5周齡SD大鼠，無菌條件下取雙側股骨，聯(lián)合應用密度梯度離心和貼壁篩選法分離、培養(yǎng)大鼠骨髓中的MSCs。傳至第4代，應用流式細胞儀進行細胞膜表面分子CD29、CD34、CD45及CD71的水平檢測分析。治療前胰酶消化，離心，生理鹽水洗滌2遍重懸成細胞懸液備用。

1.2.2 實驗分組 取健康、雄性、5周齡、體質(zhì)量（100±20）克／只SD大鼠50只，適應性飼養(yǎng)3d后按照隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組：第1組為模型組（n＝20），第2組為正常對照組（n＝10），第3組為MSCs治療組（n＝10），第4組為 MSCs干預組（n＝10）。

1.2.3 AA大鼠模型的制備 模型組取弗氏完全佐劑［3］，充分振蕩、混勻，75%乙醇消毒大鼠右后足，無菌皮試針于右后足跖皮內(nèi)一次性注射每只0.1mL。正常對照組大鼠代以注射等量的生理鹽水。觀察4組大鼠的呼吸、精神狀態(tài)、活動、進食、飲水、體質(zhì)量等情況。在造模第1、7、14、21d分別稱量大鼠體質(zhì)量，軟尺測量雙踝關節(jié)周長，排水法測量足爪體積。排水法測足爪體積，即在大鼠足部踝骨關節(jié)突出部位劃一條線作為標記，用一特制量筒，灌滿水后，將大鼠足爪插入，使踝關節(jié)骨上的標記處于水平面，另用一個燒杯接從量筒側口排出的水，測量排出水的量（mL）即為所測大鼠足爪的體積。造模第21天從模型組隨機分出10只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，四肢關節(jié)做X線片攝片（采用牙片X光機，電壓65kV，電流7 mA，曝光時間0.10ms）及常規(guī)HE染色病理切片，進行動物模型的鑒定［4］。

1.2.4 MSCs的治療和干預 將上述4組大鼠做如下處理：MSCs治療組于造模第21天舌下靜脈緩慢一次性注射5×106／mL的MSCs細胞懸液1mL。MSCs干預組于造模第1天MSCs治療，方法同MSCs治療組。模型組和正常對照組不做任何處理。

1.2.5 MSCs治療、干預后相關指標的檢測 從注射MSCs細胞懸液起，分別于第1、7、14、21、28天測量大鼠體質(zhì)量、雙側踝關節(jié)周長和后足爪體積（方法同前）。并觀察大鼠活動、食欲、毛色等情況。各組大鼠在治療后第28天，麻醉后行四肢關節(jié)X線片檢查（方法同前）。之后頸椎脫臼處死，取四肢關節(jié)做病理檢查。

1.2.6 治療相關不良反應的觀察 全程觀察各治療及干預組大鼠有無過敏反應及不良反應發(fā)生。

1.3 統(tǒng)計學處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理。所得結果計量資料用表示，采用單因素方差分析，在總體水平有差異的情況下，各組和模型組比較采用LSD法，組間比較采用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠MSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及收集 倒置相差顯微鏡觀察可見原代培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)24h后貼壁，1周后集落迅速增多，擴大并融合，鋪滿培養(yǎng)瓶底面，予以傳代培養(yǎng)。傳至第4代，細胞呈梭形，漩渦狀生長（圖1）。行流式細胞儀檢測結果顯示大鼠 MSCs：CD71＋、CD29＋，而CD34－、CD45－，符合MSCs的生物學特征［5］。

2.2 造模、治療及干預后大鼠生存狀況及體質(zhì)量、足爪變化情況 在造模期間動物無死亡，造模后動物較第2組活動明顯減少，毛發(fā)直立，晦暗無光澤，食欲下降，關節(jié)腫脹進行性加重。體質(zhì)量均有不同程度的增長，但第1組大鼠體質(zhì)量的增長明顯小于第2組。右足致炎后3d腫脹達一個高峰，持續(xù)4～5d后逐漸減輕，1周后再度腫脹，繼發(fā)病變出現(xiàn)于致炎后的2周左右，表現(xiàn)為同側和對側及前足腫脹，且進行性加重。在第3組一次性注射MSCs后，大鼠毛發(fā)漸光澤，食欲好轉(zhuǎn)，四肢關節(jié)腫脹程度逐漸緩解，趨于正常對照組。第4組，造模后3d內(nèi)局部（原發(fā)側）略微紅腫，繼而于1周左右紅腫消退，之后患側、對側及前肢在干預后的21d內(nèi)均未見明顯紅腫、強直及活動受限。第3、4組體質(zhì)量與第2組體質(zhì)量增長相當，相對第1組體質(zhì)量有明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而第1組與第2照組體質(zhì)量增長明顯偏離，體質(zhì)量增長緩慢。第3組足踝關節(jié)周長與足爪體積增長曲線趨于第2組，與第1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。第4組踝關節(jié)周長與足爪體積增長曲線與第2組基本吻合，與第1組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1～5。

圖1 第4代骨髓間充質(zhì)干細胞（100×）

2.3 影像學變化 與第2組相比（圖2A），第1組可見周圍軟組織影增厚，骨性關節(jié)面模糊不清，有鋸齒狀改變，關節(jié)邊緣骨質(zhì)破壞（圖2B）。第3組大鼠后肢雙側足趾關節(jié)較模型組周圍軟組織影增厚減輕，骨性關節(jié)面光滑，關節(jié)邊緣骨質(zhì)破壞明顯修復（圖2C）。第4組的周圍軟組織影未見明顯增厚，骨性關節(jié)面光滑，關節(jié)邊緣骨質(zhì)未見明顯破壞，與第2組無明顯差異。

圖2 大鼠關節(jié)影像學表現(xiàn)

表1 各組大鼠的體質(zhì)量變化情況（g，）

表1 各組大鼠的體質(zhì)量變化情況（g，）

＊：P＜0.05，與第1組比較；－：表示無數(shù)據(jù)。

1 20107.60±9.24118.80±11.32131.20±21.48151.20±19.87175.40±28.47205.80±26.86221.40±18.15247.00±3.942 10102.60±9.10121.00±9.90147.40±7.40175.20±6.46＊ 208.60±7.80＊ 250.40±10.29＊ 278.40±8.44＊ 305.80±9.96＊3 10101.60±9.10122.00±12.73144.80±13.59167.80±13.22193.00±15.89234.20±22.20＊ 268.60±22.23＊ 300.20±18.24＊4 10100.60±9.18120.20±8.87144.80±13.92＊ 170.40±13.22＊ 198.80±22.24＊ － － －F 0.12 0.78 0.22 1.95 4.91 12.70 15.59 41.88

表2 大鼠右踝關節(jié)周長變化（cm，）

表2 大鼠右踝關節(jié)周長變化（cm，）

＊：P＜0.05，與第1組比較；－：表示無數(shù)據(jù)。

1 201.96±0.052.22±0.082.36±0.092.42±0.082.54±0.092.60±0.072.66±0.112.68±0.082 101.98±0.081.98±0.08＊ 2.06±0.11＊ 2.08±0.08＊ 2.14±0.11＊ 2.16±0.11＊ 2.22±0.08＊ 2.22±0.08＊3 101.96±0.052.22±0.082.40±0.122.58±0.132.64±0.052.64±0.052.50±0.07＊ 2.30±0.07＊4 101.96±0.052.00±0.07＊ 2.00±0.07＊ 2.08±0.04＊ 2.10±0.07＊ － － －F 0.11 12.24 9.04 21.68 24.85 36.00 32.25 31.24

表3 大鼠左踝關節(jié)周長變化（cm，）

表3 大鼠左踝關節(jié)周長變化（cm，）

＊：P＜0.05，與第1組比較；－：表示無數(shù)據(jù)。

組別 n 致炎前致炎后1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周1 201.96±0.051.96±0.052.04±0.112.10±0.102.18±0.112.30±0.122.38±0.082.46±0.052 101.98±0.081.98±0.082.06±0.11＊ 2.08±0.08＊ 2.14±0.11＊ 2.16±0.11＊ 2.22±0.08＊ 2.22±0.08＊3 101.96±0.051.96±0.052.08±0.082.24±0.112.30±0.072.34±0.052.30±0.00＊ 2.24±0.05＊4 101.96±0.052.00±0.072.00±0.07＊ 2.06±0.05＊ 2.10±0.07＊ － － －F 0.11 0.90 2.14 3.28 2.79 3.86 9.14 22.13

表4 大鼠右足體積變化（mL，）

表4 大鼠右足體積變化（mL，）

＊：P＜0.05，與第1組比較；－：表示無數(shù)據(jù)。

1 200.84±0.051.00±0.141.18±0.081.36±0.051.58±0.131.86±0.092.08±0.132.24±0.112 100.84±0.050.90±0.070.96±0.05＊ 1.00±0.07＊ 1.02±0.04＊ 1.08±0.04＊ 1.12±0.04＊ 1.16±0.05＊3 100.90±0.071.16±0.111.40±0.071.66±0.111.62±0.131.42±0.08＊ 1.28±0.04＊ 1.20±0.07＊4 100.88±0.100.90±0.08＊ 0.93±0.10＊ 0.98±0.10＊ 1.05±0.06＊ － － －F 0.66 12.20 25.42 27.17 25.67 26.83 38.59 100.13

表5 大鼠左足體積變化（mL，）

表5 大鼠左足體積變化（mL，）

＊：P＜0.05，與第1組比較；－：表示無數(shù)據(jù)。

組別 n 致炎前致炎后1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周1 200.84±0.050.96±0.111.02±0.081.14±0.091.22±0.131.42±0.161.64±0.221.86±0.152 100.84±0.050.90±0.070.96±0.05＊ 1.00±0.07＊ 1.02±0.04＊ 1.08±0.04＊ 1.12±0.04＊ 1.16±0.05＊3 100.90±0.070.96±0.091.06±0.091.20±0.071.32±0.081.26±0.09＊ 1.24±0.09＊ 1.18±0.04＊4 100.86±0.090.90±0.070.92±0.08＊ 0.98±0.08＊ 1.00±0.07＊ － － －F 0.66 0.79 2.57 6.64 24.61 41.70 56.10 51.74

圖3 關節(jié)病理切片HE染色（40×）

2.4 關節(jié)組織病理學檢查結果 常規(guī)HE染色病理切片示：第2組大鼠關節(jié)滑膜組織正常，未見增生及炎性細胞浸潤；關節(jié)面光滑，骨質(zhì)無破壞，關節(jié)間隙正常（圖3A）。第1組大鼠在右后足（即注射足）中觀察到關節(jié)周圍有大量的淋巴細胞浸潤；左后足（即對側足）和前足病變關節(jié)中出現(xiàn)滑膜增生，可達6～8層，有淋巴細胞浸潤，有些軟骨帽消失，嚴重的甚至炎性細胞已侵蝕到軟骨中，關節(jié)腔完全消失，纖維化（圖3B）。第3組的后肢足趾關節(jié)與模型組相比，關節(jié)面較光滑，關節(jié)邊緣骨質(zhì)破壞減輕，關節(jié)間隙出現(xiàn)（圖3C）。第4組關節(jié)結構清楚，滑膜組織基本正常，未見明顯增生及炎性細胞浸潤；關節(jié)面較光滑，關節(jié)邊緣骨質(zhì)未見明顯破壞，關節(jié)間隙正常。

2.5 治療后相關不良反應的觀察 本實驗全程觀察到第3、4組大鼠治療過程中無呼吸急促，皮膚無皮疹，大便干燥、顆粒狀，大鼠活動自如，食欲佳。不良反應表現(xiàn)不明顯，肝臟、腎臟、脾臟、胸腺及睪丸等各大臟器未見腫瘤發(fā)生。

3 討 論

該研究選用增殖旺盛且純化的第4代的MSCs對大鼠AA進行治療和干預，實驗初步證實MSCs對AA大鼠動物模型具有治療和干預作用，MSCs能有效改善AA大鼠的生存狀況和相關癥狀，并干預大鼠AA的發(fā)生。

RA是一種致殘率很高的疾病，其發(fā)生與免疫功能紊亂有關。傳統(tǒng)的藥物治療多數(shù)僅能緩解癥狀，而難以治愈。Chiesa等［2］和Cutler等［6］報道：MSCs在體外的混合淋巴細胞反應體系中不誘發(fā)同種異體外周血單個核細胞的增殖，使T細胞的增殖幾乎被完全抑制，提示MSCs具有較為獨特的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)性。研究發(fā)現(xiàn)，自體或異體的MSCs加入到有絲分裂原刺激的外周血淋巴細胞培養(yǎng)體系中，均能明顯抑制T淋巴細胞的增殖活化［7］。此外，有學者發(fā)現(xiàn)即使MSCs分化成其他類型的細胞，也繼續(xù)保留它的免疫調(diào)節(jié)作用［8］，并能避免移植物抗宿主病的發(fā)生［9］?；A研究證實MSCs在體內(nèi)外可以分化為成骨、軟骨、脂肪、腱、肌肉等細胞［10－11］，可能參與受損組織的再生修復；MSCs具有趨化作用，可以阻止炎性介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應，減輕組織損傷，有利于阻止病情進展；MSCs還能分泌多種細胞因子，具有營養(yǎng)作用，能促進干細胞的增殖和分化［12］。關節(jié)病變可以促進 MSCs向病變滑膜聚集，從而修復損傷的關節(jié)組織［13］。

MSCs對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起重要的作用，有望從根本上調(diào)整患者病態(tài)免疫系統(tǒng)［14－15］；且 MSCs作為成體干細胞，較胚胎干細胞而言形成腫瘤的傾向極低，在目前發(fā)表的資料中未見報道，并且不存在倫理學上的爭議。實驗結果初步表明MSCs治療RA是有效、安全可行的。MSCs或?qū)樽陨砻庖咝约膊∧酥疗渌膊〉闹委熖峁┬碌乃悸贰?/p>

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