人皮膚鱗狀細(xì)胞癌體外三維模型的建立及高侵襲性鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)評(píng)價(jià)＊

楊曉鯤，楊亞?wèn)|，楊桂紅，唐書(shū)謙，伍津津

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所皮膚科，重慶 400042）

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（the human shin squamous－celled carcinoma，SCC），是皮膚腫瘤中侵襲性、致死性較強(qiáng)的一類，對(duì)其研究一直都是熱點(diǎn)。以往研究者借助普通的二維細(xì)胞培養(yǎng)和鱗癌動(dòng)物模型進(jìn)行研究，本試驗(yàn)中，通過(guò)建立SCC三維培養(yǎng)模型，并進(jìn)一步篩選出具有更高侵襲性的SCC細(xì)胞亞群，并比較兩種細(xì)胞亞群之間的生物學(xué)特性，為臨床治療SCC提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～3個(gè)月雄性裸鼠40只，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所提供。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 人表皮鱗癌細(xì)胞株A－431細(xì)胞株（TCHu188，上海細(xì)胞生物研究所），人源角質(zhì)形成細(xì)胞（KC細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞（FB細(xì)胞）為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凍存?zhèn)溆茫笪材z原按本科方法制備［1］；肉桂醛（Sigma公司）；注射用重組人干擾素α1b（IFNα1b）（賽若金，每支1mL∶30μg，國(guó)藥準(zhǔn)字S10960059，深圳科興生物工程有限公司）；層粘連蛋白，普通和高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT粉）、表皮生長(zhǎng)因子、殼多糖、硫酸軟骨素C、透明質(zhì)酸（均為SIGMA產(chǎn)品），HEPES（美國(guó)KAI生物醫(yī)學(xué)科學(xué)公司），膠原酶D（德國(guó)寶靈曼公司）；胰蛋白酶（中國(guó)科學(xué)院新疆化學(xué)研究所）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），二氧化碳孵箱TC2323型（SHEL LAB公司），HY－4調(diào)速多用振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）；酶標(biāo)儀（Biotek ELx800，USA）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（HK97CASY－TT）。

1.2 方法

1.2.1 A431細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代 向A431細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入2mL 0.01mol／L的磷酸鹽緩沖液（PBS），清洗2次，倒掉培養(yǎng)基，加入0.25%胰酶4℃冷消化30min，后輕輕拍打培養(yǎng)瓶壁，加入1mL胎牛血清終止消化后按1∶2～1∶4傳代擴(kuò)增，以此獲得的A431細(xì)胞記為Ⅰ組。KC細(xì)胞和FB細(xì)胞從臨床健康成人包皮標(biāo)本獲取，并常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 建立A431鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型 參照以往研究［1］在6孔培養(yǎng)板上制作組織工程凝膠，將FB 1.5×105個(gè)細(xì)胞／孔混入凝膠中，待凝膠凝固后，再按照A4310.5×105個(gè)細(xì)胞／孔、KC 2×105個(gè)細(xì)胞／孔的比例加入凝膠中，進(jìn)行A431三維培養(yǎng)模型的建立，分為 A、B、C、D組（分別對(duì)應(yīng)5、7、10、14d），各重復(fù)2組（一組觀察鱗癌細(xì)胞浸潤(rùn)情況，另一組消化提取細(xì)胞）。為改善培養(yǎng)環(huán)境，利用振蕩器進(jìn)行振蕩培養(yǎng)；并在5、7、10、14d取出標(biāo)本，甲醛液固定，常規(guī)HE染色，鏡下觀察A431細(xì)胞浸潤(rùn)情況。之后將D組表皮層中細(xì)胞去除，加入2%膠原酶D消化，獲得浸入真皮層的A431細(xì)胞，培養(yǎng)傳代后，再次按前述各細(xì)胞數(shù)量接種于組織工程凝膠中，并分為a、b、c、d組，可再次重復(fù)2組，以獲取侵襲特性更強(qiáng)的鱗癌細(xì)胞，并將此A431細(xì)胞記為Ⅱ組（普通培養(yǎng)A431細(xì)胞為Ⅰ組）。

1.2.3 肉桂醛溶液、IFNα1b溶液及0.5%MTT液的配制肉桂醛溶液配制以0.2%二甲基亞砜溶液作為溶劑，將肉桂醛溶液和高糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)避光振蕩5min，0.22μm 濾膜過(guò)濾，分別配制成100μL的100、200、400μmol／L 3種 濃度，于 4℃ 保存?zhèn)溆谩FNα1b溶 液 配制：30μg／mL IFNα1b用無(wú)血清DMEM作為稀釋劑，分別稀釋成3、2、1μg／mL濃度并置于4℃保存?zhèn)溆谩?.5%MTT液配制：將50mg MTT混合于10mL的0.01M磷酸鹽緩沖液中，振搖、溶解，0.22μm濾膜過(guò)濾，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 MTT法測(cè)定A431細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A431細(xì)胞，無(wú)菌PBS洗滌3次后0.25%胰酶消化，觀察細(xì)胞收縮變圓后終止消化。1200r／min離心5min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，按2×104個(gè)細(xì)胞／100微升接種于96孔板，每孔100μL，置入37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后分別加入肉桂醛0、100、200、400μmol／L（對(duì)應(yīng)配制好的肉桂醛溶液加入量分別為0.0、12.5、25.0、50.0μL）。每組5復(fù)孔（n＝5），置入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48和72h后每孔加入5g／L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入二甲基亞砜150μL，避光振蕩10min，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)量光密度值。

1.2.5 裸鼠成瘤模型的建立及不同侵襲性A431細(xì)胞成瘤活性的比較 按接種A431細(xì)胞的不同分為Ⅰ、Ⅱ組，并按照接種后裸鼠生長(zhǎng)時(shí)間分為3、4、5、6周組，每組5只，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌3次，3000r／min離心3min，棄上清液。加PBS液稀釋，制成單細(xì)胞懸液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／mL，裸鼠背部皮膚用75%乙醇進(jìn)行消毒，以1mL注射器吸取0.1mL細(xì)胞懸液，數(shù)量為2×106個(gè)，注射入裸鼠背部皮下組織，注射完畢后觀察裸鼠，無(wú)異樣反應(yīng)，繼續(xù)放于無(wú)菌飼養(yǎng)房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，并觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，并在一定時(shí)間內(nèi)脫頸法處死裸鼠，留取腫瘤標(biāo)本，后用體積公式：V＝0.5×a×b2，（a為長(zhǎng)徑，b為短徑）計(jì)算腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，細(xì)胞增殖抑制率等采用χ2檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 A431鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型的建立 由圖1可觀察到，作者建立的組織工程皮膚表真皮分化明顯，形成較之普通傳統(tǒng)培養(yǎng)形式不同的三維立體結(jié)構(gòu)，以標(biāo)志性的基底膜為界，上為組織工程皮膚表皮部分，而下為組織工程的真皮凝膠部分，并且從三維培養(yǎng)的第5天開(kāi)始，組織工程皮膚真皮凝膠層中可見(jiàn)到核異型性明顯的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，浸潤(rùn)入真皮層內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)腫瘤浸潤(rùn)的廣度和深度都有所增加，到第14天時(shí)達(dá)到高峰。結(jié)果提示鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型建立成功。

圖1 各組A431鱗癌細(xì)胞組織學(xué)觀察（HE×10）

表1 不同濃度肉桂醛對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

表1 不同濃度肉桂醛對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

aP＜0.01，與無(wú)藥物對(duì)照組比較；b：P＜0.01，與100μmol／L比較；c：P＜0.01，與200μmol／L比較。

濃度（μmol／L）24hⅠ組 Ⅱ組48hⅠ組 Ⅱ組72hⅠ組 Ⅱ組0000000100 13.15±2.12a 18.53±1.71a 21.67±1.53a 24.56±2.32aa 28.35±4.61a 35.51±4.93a 200 26.75±3.53ab 32.27±2.61ab 32.76±3.53ab 40.46±5.52ab 47.65±7.24ab 59.21±5.24ab 400 44.35±3.44abc 56.45±4.22abc 65.21±5.02abc 76.65±3.54abc 73.45±3.55abc 85.65±4.31abc

表2 不同濃度IFNα1b對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

表2 不同濃度IFNα1b對(duì)Ⅰ組、Ⅱ組A431細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

a：P＜0.01，與無(wú)藥物對(duì)照組比較；b：P＜0.01，與100μmol／L比較；c：P＜0.01，與200μmol／L比較。

濃度（μmol／L）24hⅠ組 Ⅱ組48hⅠ組 Ⅱ組72hⅠ組 Ⅱ組0000000100 19.75±3.16a 26.50±2.30a 23.65±7.12a 29.94±6.24a 31.65±3.23a 37.33±4.49a 200 23.46±2.17ab 31.46±3.27ab 28.45±3.52ab 34.65±3.38ab 36.45±4.26ab 40.38±3.99ab 400 27.76±3.24abc 38.34±4.25abc 37.86±2.15abc 45.25±4.65abc 45.35±6.26abc 51.65±2.37abc

2.2 肉桂醛和IFNα1b對(duì)不同侵襲性的A431細(xì)胞增殖活性的影響 隨著肉桂醛、IFNα1b濃度的增加，鱗癌細(xì)胞被抑制率也隨之增高，且Ⅰ組、Ⅱ組間對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。隨著藥物濃度的增加，鱗癌細(xì)胞被抑制率也隨之增高，且Ⅰ組、Ⅱ組間對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。接種后，Ⅱ組裸鼠形成的腫瘤較Ⅰ組體積更大，質(zhì)量更重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 兩組A431細(xì)胞成瘤活性的比較（，n＝20）

表3 兩組A431細(xì)胞成瘤活性的比較（，n＝20）

a：P＜0.01，與Ⅰ組比較。

體積（mm3）組別3周 4周 5周 6周腫瘤質(zhì)量（g）Ⅰ組393±41 598±53 798±711553±1275.38±0.58Ⅱ組 379±36a 522±66a 701±82a1123±105a3.05±0.37a

3 討 論

SCC在皮膚腫瘤中發(fā)生率較高，對(duì)于它的治療方法和基礎(chǔ)研究很多，本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用SCC A431細(xì)胞建立了SCC體外三維培養(yǎng)模型，并篩選出侵襲性更強(qiáng)的A431細(xì)胞亞群，并將這兩類細(xì)胞的生物學(xué)特性做了比較，證明了鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型的有效性，為今后SCC的臨床治療和科研研究提供良好的體外培養(yǎng)模型。

眾所周知，目前腫瘤研究的主要手段集中于腫瘤細(xì)胞的二維培養(yǎng)、動(dòng)物荷瘤模型和自發(fā)性動(dòng)物腫瘤模型等方面，都存在著明顯的局限性，與臨床腫瘤診治往往存在偏差［2－3］。而三維培養(yǎng)，有利于種植細(xì)胞固有的生物學(xué)特性的維持［4］，可以較為真實(shí)地再現(xiàn)體環(huán)境中細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互間的作用。目前，已經(jīng)在腫瘤形態(tài)發(fā)生、侵襲性生長(zhǎng)及化療藥物的藥理毒理的研究中提供了比較有價(jià)值的研究手段［5－6］。例如，有學(xué)者將乳腺癌（SUM1315、MDA－MB－231）、前列腺癌（LNCaP）細(xì)胞株種植于聚已酸內(nèi)酯磷鹽三鈣（mPCL－TCP）、聚甲基丙稀酸－2－羥乙酯（polyHEMA）、Matrigel等支架材料中，并在三維培養(yǎng)條件下形成腫瘤團(tuán)塊［7－8］，并維持了惡性腫瘤的生物學(xué)特性［9－10］。

在本次實(shí)驗(yàn)中，利用復(fù)方殼多糖真皮基質(zhì)凝膠這一三維培養(yǎng)支架為基礎(chǔ)，本研究成功地建立了SCC體外三維培養(yǎng)模型，這與目前腫瘤侵襲性研究采用的細(xì)胞侵襲測(cè)定裝置系統(tǒng)如CytoSelect系統(tǒng)［11］、聚碳酸酯濾器穿壁系統(tǒng)［12］相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可以真實(shí)反映在體情況下腫瘤突破表皮層而進(jìn)入真皮層的失衡過(guò)程，同時(shí)能夠獲得這一類鱗癌細(xì)胞亞群。經(jīng)過(guò)肉桂醛和IFNα1b對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增加，鱗癌細(xì)胞被抑制率也隨之增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中肉桂醛在濃度為400μmol／L、作用時(shí)間為72h時(shí)，對(duì)兩組細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到（85.65±4.31）%和（73.45±3.55）%。而IFNα1b在濃度為400μmol／L、作用時(shí)間為72h時(shí)，對(duì)兩組細(xì)胞的抑制率則分別達(dá)到了（51.65±2.37）%和（45.35±6.26）%，同時(shí)這兩組實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞之間比較，相同濃度藥物和相同藥物作用時(shí)間對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。另外，兩種不同侵襲特性的細(xì)胞亞群的成瘤特性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

綜上所述，本研究體外構(gòu)建鱗癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型是成功的，通過(guò)此模型，也能夠篩選出侵襲性更強(qiáng)的鱗癌細(xì)胞，這對(duì)構(gòu)建其他皮膚惡性腫瘤的三維培養(yǎng)模型、治療藥物篩選與評(píng)價(jià)都有重要的理論和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)價(jià)值。至于如何維持此種腫瘤三維培養(yǎng)模型的穩(wěn)定性，以及本次研究中的皮膚鱗癌細(xì)胞侵入真皮層的具體機(jī)制，需要在今后的實(shí)驗(yàn)工作中繼續(xù)探討。

［1］魯元?jiǎng)偅榻蚪?，雷霞，?培養(yǎng)基鈣濃度對(duì)復(fù)方殼多糖組織工程皮膚基底膜構(gòu)建的形態(tài)學(xué)研究［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2007，21（3）：298－301.

［2］Eager RM，Cunningham CC，Senzer NN，et al.Phase Ⅱassessment of talabostat and cisplatin in second－line stageⅣ melanoma［J］.BMC Cancer，2009，9（7）：263－278.

［3］Hutmacher DW，Loessner D，Rizzi S，et al.Can tissue engineering concepts advance tumor biology research？［J］.Trends Biotechnol，2010，28（3）：125－133.

［4］Yamada KM，Cukierman E.Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D［J］.Cell，2007，130（4）：601－610.

［5］Furth ME，Atala A，Van Dyke ME.Smart biomaterials design for tissue engineering and regenerative medicine［J］.Biomaterials，2007，28（34）：5068－5073.

［6］Dutta RC，Dutta AK.Cell－interactive 3D－scaffold；advances and applications［J］.Biotechnol Adv，2009，27（4）：334－339.

［7］Fischbach C，Kong HJ，Hsiong SX，et al.Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3Dculture and integrin engagement［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（2）：399－404.

［8］Wang R，Xu J，Juliette L，et al.Three－dimensional co－culture models to study prostate Cancer growth，progression，and metastasis to bone［J］.Semin Cancer Biol，2005，15（5）：353－364.

［9］Ingber DE.Can Cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment？［J］.Semin Cancer Biol，2008，18（5）：356－364.

［10］Hutmacher DW，Singh H.Computational fluid dynamics for improved bioreactor design and 3Dculture［J］.Trends Biotechnol，2008，26（4）：166－172.

［11］Cabello CM，Bair WB，Lamore SD，et al.The cinnamonderived Michael acceptor cinnamic aldehyde impairs melanoma cell proliferation，invasiveness，and tumor growth［J］.Free Radic Biol Med，2009，46（2）：220－231.

［12］Kim A，Son M，Kim KI，et al.Elevation of intracellular cyclic AMP inhibits NF－κB－mediated thymosinβ4expression in melanoma cells［J］.Exp Cell Res，2009，15（19）：3325－3335.