肉雞源致病性大腸埃希菌中β-內酰胺類抗生素耐藥基因的檢測

金 彪，伍成奇，唐 攀，邱淵皓，劉萬華，武 寧，王晶鈺

（西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100）

β-內酰胺類抗生素包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類、碳青霉烯類和青霉烯類酶抑制劑等。頭孢菌素類抗生素是從頭孢菌素的母核7-氨基頭孢烷酸連接不同側鏈而制成的半合成抗生素。藥物首先發(fā)現(xiàn)于1945年［1］，經過一段時間的實驗室研究，于1963年被正式應用于臨床當中，并且根據(jù)臨床的應用情況不斷改進。由于頭孢菌素類抗生素的廣泛應用，其耐藥性問題日趨嚴重，給臨床治療帶來了困難。大腸埃希菌（E.coli）產β-內酰胺酶是β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的主要機制，由質粒介導的超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是新一代β-內酰胺酶類抗生素耐藥的主要原因，使包括第三代頭孢菌素在內的多種β-內酰胺類抗生素失活，還能水解第四代頭孢菌素以及單環(huán)類抗生素的質粒介導的β-內酰胺酶（β-lactamases，BLA）［2-3］。ESBLs是由質粒介導的，它可以通過接合、轉化、轉導等形式獲得或轉移耐藥基因。根據(jù)ESBLs基因和蛋白質的同源性將其分為四類，即TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型酶［4］，本次研究采用了前三類酶。目前，產β-內酰胺酶是E.coli對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性的主要機制，醫(yī)學研究較多，但國內獸醫(yī)臨床鮮有報道。因此，本研究目的是了解雞源致病性E.coli對β-內酰胺類抗生素的耐藥情況及耐藥基因與耐藥性的相關性，旨在為臨床合理用藥以及E.coli耐藥機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源及其培養(yǎng) 108株雞源致病性E.coli，2012年8月～10月先后分離自陜西省幾個主要規(guī)?；B(yǎng)雞場的雞群。無菌操作采集上述規(guī)?；B(yǎng)雞場的雞群疑似感染E.coli的病、死雞肺臟、肝臟樣本，接種麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基初步分離，通過培養(yǎng)特性觀察、生化試驗、動物致病性試驗共分離鑒定出108株致病性E.coli，由西北農林科技大學動物醫(yī)學院動物性食品衛(wèi)生檢驗實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及藥敏紙片 麥康凱瓊脂和營養(yǎng)瓊脂，購自北京奧博星生物技術有限公司；細菌微量生化反應管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；7種β-內酰胺類藥敏紙片（頭孢派酮、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢呋肟、頭孢噻吩），購自杭州天和微生物試劑公司。

1.1.3 主要試劑 PCR Master Mix（含Taq DNA聚合 酶、dNTP、PCR buffer）、DNA Marker DL 2 000，購自寶生物工程（大連）有限公司；NaCl，購自四川西隴化工有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨，購自英國Oxoid公司；溴化乙錠（100mg），購自廣州寶泰克生物科技有限公司；瓊脂糖，西班牙Biowest公司產品；膠回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.1.4 耐藥基因引物設計 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的β-內酰胺酶的耐藥基因序列，用Primer5.0軟件分別設計針對β-內酰胺酶tem、ctx-m和shv的3種特異性引物，設計的引物序列見表1。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 PCR擴增引物Table 1 The primers for PCR amplification

1.2 方法

1.2.1 細菌的藥物敏感性試驗 參照CLSI（clinical and laboratory standards institute）推薦的K-B藥敏紙片法對108株雞源致病性E.coli進行藥物敏感性試驗，判定結果參照CLSI手冊中藥物敏感性標準［5］。

1.2.2 耐藥基因的PCR擴增 將待檢菌株劃線接種麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24h，挑取菌落溶于500μL無菌純水的離心管中制成濃菌懸液，100℃煮沸10min，12 000r／min離心5min，取上清作為模板，并保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR反應體系：2×PCR Master Mix（含有2×TaqDNA 聚合酶，2×PCR buffer 和 2×dNTP）10μL，10 pmol／μL上、下游引物各0.5μL，ddH2O 10μL，模板為4μL。PCR反應條件：95℃預變性5min；94℃50s，50s，72 ℃ 60s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4℃結束反應。取10μL產物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像儀成像觀察拍照。

1.2.3 PCR產物的測序分析 將耐藥基因的PCR陽性產物用膠回收試劑盒回收，送由南京金斯瑞生物科技有限公司進行序列測定，用DNA Star軟件對測序獲得的耐藥基因序列與GenBank中的相關序列進行比對分析。

2 結果

2.1 致病性E.coli分離株的耐藥性

108株雞源致病E.coli分離株的藥敏試驗結果見表2。

從表2可以看出，7種β-內酰胺類藥物中，致病性E.coli對頭孢噻吩的耐藥率最高（95.7%），對頭孢他啶的耐藥率最低（18.5%），其余的耐藥率均超過70%?？偟膩砜矗虏⌒訣.coli對頭孢菌素類藥物的耐藥率均較高。

表2 分離的致病性E.coli的耐藥情況Table 2 Antimicrobial resistance of pathogenic Escherichia coli isolated from chickens

2.2 致病性E.coli分離株耐藥基因的PCR檢測

采用PCR技術，對108株雞源致病性E.coli分離株進行了3種β-內酰胺酶耐藥基因的擴增檢測，tem和ctx-m2種耐藥基因被檢出，獲得與預期目的片段大小相符的擴增條帶（圖1，圖2），檢出率分別為98.1%和74.1%，未檢測到shv基因

2.3 致病性E.coli耐藥表型與耐藥基因檢出情況比較

耐藥基因在雞源致病性E.coli耐藥菌株中的檢出情況見表3。從表3可以看出，耐藥基因tem在頭孢他啶和頭孢呋肟耐藥菌株中檢出率最高，達100%，除了在頭孢曲松耐藥菌株中為79.6%外，其余的檢出率都超過了95%，與菌株耐藥性有顯著相關性（P＜0.05）；耐藥基因ctx-m在頭孢噻吩耐藥菌株中檢出率最高達86.3%，最低的是在頭孢他啶耐藥菌株也達到了50%，與菌株耐藥性有顯著相關性（P＜0.05）；tem＋ctx-m兩種耐藥基因的檢出率除了在頭孢他啶耐藥菌株中與ctx-m的一樣外，其余的都比ctx-m的檢出率略低。耐藥基因shv的檢出率為0。

圖1 tem陽性菌株PCR產物擴增圖Fig.1 PCR products of tem positive isolates

圖2 ctx-m陽性菌株PCR產物擴增圖Fig.2 PCR products of ctx-m positive isolates

表3 致病性E.coli耐藥株耐藥基因的檢出率Table 3 Detection rates of resistance genes in resistant isolates of pathogenic Escherichia coli

2.4 耐藥基因測序分析

檢出的2種β-內酰胺酶耐藥基因的特異性目的條帶，經回收測序后，分別與GenBank中的相應序列進行比對，結果顯示，陽性菌株攜帶的β-內酰胺酶耐藥基因與GenBank中提供的相應基因序列相似性均高達98%以上，其中tem基因為99.3%，ctx-m為98.6%。

3 討 論

β-內酰胺類藥物是醫(yī)學臨床上應用最為廣泛的抗菌藥物之一，在獸醫(yī)臨床上也發(fā)揮著及其重要的作用，隨著該類藥物的大量使用，耐藥性問題也越來越突出，嚴重影響了該藥物的臨床療效，已成為國內外耐壓性研究關注的焦點。目前在許多國家和地區(qū)有大量關于E.coli耐藥性的研究［6-7］，E.coli的耐藥性已經成為全球性問題。目前，在已發(fā)現(xiàn)的ESBLs基因型中，tem有168種，shv有114種，ctx-m有89種［8］。tem已是ESBLs中最常見的基因型廣譜抗生素，特別是第三代頭孢菌素在臨床上的廣泛使用以來，使得質粒介導的產ESBLs細菌在中國不同地區(qū)廣泛傳播［9］。本文PCR結果顯示陜西部分地區(qū)tem基因檢出率最高。

張利勃等［10］研究發(fā)現(xiàn)，遼寧省ESBLs雞源E.coli基因亞型以tem為主，其次為ctx-m型，未發(fā)現(xiàn)shv型基因，與本研究結果一致。

國內外對E.coli中質粒介導的耐藥基因已有報道，但是種類單一，對于雞源致病性E.coli耐藥基因的全面研究和報道相對較少。Meunier D等［11］對法國E.coli分離株進行β-內酰胺酶基因研究，發(fā)現(xiàn)blaTEM和blaCTX-M的檢出率分別為62.5%和100%。

Li L等［12］研究發(fā)現(xiàn)，我國雞源E.coli中β-內酰胺酶基因blaTEM和blaSHV在1970年-2003年檢出率有所下降，2004年-2007年又逐漸上升。Tang X等［13］對我國2004年-2007年豬源致病性E.coli耐藥基因檢測時發(fā)現(xiàn)，β-內酰胺類耐藥基因以blaTEM為主，檢出率為87%；楊澍等［14］對人源E.coliβ-內酰胺酶耐藥基因進行檢測發(fā)現(xiàn)，耐藥基因以blaTEM為主，本研究結果與其基本一致，這可能與耐藥基因在細菌間轉移有關。Jacob S等［15］報道，ESBLs菌可通過接合、轉化和轉導等方式使耐藥菌基因在細菌間快速傳播擴散，給臨床治療帶來困難，進一步說明加強β-內酰胺酶監(jiān)測的迫切性和必要性。本研究結果為β-內酰胺類抗生素的合理使用和耐藥機制的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

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