動(dòng)物內(nèi)源性多肽CGA-N46生物信息學(xué)分析

李瑞芳，盧研博，陳士華，張慧茹，王 彬，熊前程

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

抗菌肽（antimicrobial peptides）又稱抗微生物肽或肽抗生素，是動(dòng)物界和植物界的先天免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生的分子量在4ku左右、具有抑菌性質(zhì)的堿性多肽物質(zhì)。從目前的研究來看，抗菌肽廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗病毒活性，構(gòu)成機(jī)體的“第二防御體系”。因此，抗菌肽是存在于動(dòng)植物、昆蟲、微生物等生物體內(nèi)，具有抗菌活性的肽類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽水溶性好、分子質(zhì)量小、呈強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性高、無免疫原性，有著與傳統(tǒng)抗生素完全不一樣的產(chǎn)生途徑和作用機(jī)制，病原菌不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥性［1］。一般情況下，抗菌肽只作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞，而對(duì)常態(tài)的真核細(xì)胞幾乎沒有作用［2］。因此，抗菌肽有望被研發(fā)成替代抗生素的藥物，亦有可能成為無毒或低毒的抗腫瘤新藥［3］。肽類抗生素為新型藥物的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)很有代表性的范例［4］。

嗜鉻粒蛋白（chromogranin A，CGA）是存在于動(dòng)物神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞的由439個(gè)氨基酸組成的可溶性蛋白［5］。CGA N端衍生多肽對(duì)真菌和細(xì)菌表現(xiàn)出不同的抑制作用，其中CGA N端31位～76位氨基酸肽段（CGA-N46）具有較強(qiáng)抗真菌的功能［6］。為揭示CGA-N46的抗真菌作用、副作用及選擇性毒力的基本原理，本實(shí)驗(yàn)室正在對(duì)CGA-N46抗真菌作用機(jī)制進(jìn)行研究。利用生物信息學(xué)軟件，對(duì)CGA-N46的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等進(jìn)行分析，通過與已有抗菌肽進(jìn)行比對(duì)，推測(cè)CGA-N46的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 CGA-N46氨基酸序列 NH2-PMPVSQE CFETLRGHERILSILRHQNLLKE LQ-DL ALQGAKERAHQQ-COOH。

1.1.2 軟件和工具 ProtParam、TMpred和WoLF PSORT 工具，GOR4、SIMPA96、Signal3.0 Server、NetPhos 2.0Server和NetOGlyc 3.1Server軟件，SWISS-Model程序。

1.2 方法

1.2.1 CGA-N46理化性質(zhì)分析 利用http：／／www.expasy.ch／tools／網(wǎng)站ExPASy分析系統(tǒng)中的ProtParam工具分析CGA-N46氨基酸序列，對(duì)其氨基酸組成、電荷分布、電荷聚集區(qū)域、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、親水性和半衰期等理化參數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.2 CGA-N46二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用http：／／pbil.ibcp.fr／網(wǎng)站的secondary structure prediction軟件中的GOR4、SIMPA96方法綜合觀測(cè)CGAN46的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 CGA-N46跨膜區(qū)和信號(hào)肽分析 參照文獻(xiàn)［7］，利用 http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html網(wǎng)站SWISS-PROT的跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫Tmbase的分析工具TMpred和http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／網(wǎng)站Signal3.0 Server軟件分析CGA-N46氨基酸序列，預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)段和取向。

1.2.4 CGA-N46進(jìn)入細(xì)胞后的細(xì)胞內(nèi)定位 參照文獻(xiàn)［8］，利用網(wǎng)站http：／／psort.hgc.jp／form2.html的WoLF PSORT工具基于其氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位點(diǎn)。

1.2.5 CGA-N46糖基化和磷酸化位點(diǎn)分析 利用http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／網(wǎng)站的NetOGlyc 3.1Server軟件和http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／網(wǎng) 站 的 NetPhos 2.0 Server軟件分析CGA-N46的糖基化和磷酸化位點(diǎn)。

1.2.6 CGA-N46三維空間結(jié)構(gòu)分析 利用http：／／swissmodel.expasy.org／repositoru／網(wǎng) 站 的SWISS-Model程序預(yù)測(cè)CGA-N46的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 CGA-N46的理化性質(zhì)

CGA-N46共有46個(gè)氨基酸，其氨基酸組成見表1。由軟件分析可知，CGA-N46內(nèi)部沒有二硫鍵，帶負(fù)電荷氨基酸（Asp＋Glu）總數(shù)為6個(gè)，帶正電荷氨基酸（Arg＋Lys）總數(shù)為6個(gè)，總體電荷分布情況為：000000-00-00＋00-＋00000＋00000＋-00-000000＋-＋0000。該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為7.38，分子質(zhì)量為5 363.1u（5.363ku）。

表1 CGA-N46氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of CGA-N46

分析CGA-N46的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為75.91，為不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)疏水性的預(yù)測(cè)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少，一般根據(jù)該蛋白質(zhì)的GRAVY值來預(yù)測(cè)。GRAVY值的范圍在2與-2之間，負(fù)數(shù)表示該蛋白質(zhì)為親水蛋白，正數(shù)表示該蛋白質(zhì)為疏水蛋白。CGA-N46總平均親水性為-0.674，因而為親水蛋白。軟件分析得知，CGAN46在哺乳動(dòng)物、酵母中的半衰期都大于20h。

2.2 CGA-N46的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用 GOR4、SIMPA96方法綜合觀測(cè)CGAN46的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析可知，在CGA-N46的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋占總體二級(jí)結(jié)構(gòu)的80.43%，無規(guī)則卷曲占總體二級(jí)結(jié)構(gòu)的19.57%，因此，CGA-N46總體呈現(xiàn)α螺旋形式。其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖1所示。

圖1 CGA-N46二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Secondary structure prediction of CGA-N46

2.3 CGA-N46的跨膜區(qū)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用SWISS-PROT的跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫Tmbase的分析工具TM pred分析CGA-N46氨基酸序列，預(yù)測(cè)CGA-N46的跨膜結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CGAN46沒有跨膜的可能性，即沒有跨膜區(qū)。利用SignalP-NN軟件預(yù)測(cè)CGA-N46的信號(hào)肽序列，分析顯示該蛋白質(zhì)沒有信號(hào)肽?？缒^(qū)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CGA-N46是位于細(xì)胞質(zhì)中的胞漿蛋白。

2.4 CGA-N46在細(xì)胞內(nèi)的定位

預(yù)測(cè)結(jié)果再現(xiàn)了該蛋白的信號(hào)肽序列、核定位信號(hào)、跨膜區(qū)定位、信號(hào)序列識(shí)別、線粒體定位信號(hào)、膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等信息，結(jié)果表明CGA-N46進(jìn)入細(xì)胞之后主要分布于細(xì)胞核（52.2%），其他的依次為細(xì)胞 質(zhì) （26.1%）、細(xì) 胞 骨 架 （17.4%）和 線 粒 體（4.3%）。

2.5 CGA-N46糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)糖基化（O-Glycosylated）對(duì)蛋白質(zhì)功能具有重要影響，如許多重要的細(xì)胞表面蛋白、識(shí)別蛋白和分泌蛋白都帶有一個(gè)或數(shù)個(gè)糖基。利用NetO-Glyc 3.1Server軟件分析CGA-N46糖基化位點(diǎn)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CGA-N46沒有糖基化位點(diǎn)。

磷酸化（phosphorylation）是蛋白質(zhì)翻譯后廣泛存在的一種化學(xué)修飾，是調(diào)節(jié)酶或蛋白質(zhì)活性的重要步驟。利用 http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／網(wǎng)站的 NetPhos 2.0Server軟件分析CGA-N46磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果如表2所示。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CGA-N46有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別位于第5位絲氨酸和第11位的蘇氨酸。

表2 CGA-N46磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 2 Phosphorylation site prediction of CGA-N46

2.6 CGA-N46三維空間結(jié)構(gòu)

利用SWISS-Model程序預(yù)測(cè)CGA-N46的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果在PDB數(shù)據(jù)庫中沒有找到有效的模板，表明對(duì)該類蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究不多。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物抗菌肽多為帶陽離子電荷兩親α-螺旋構(gòu)型的多肽，其電荷特性便于其與負(fù)電荷的細(xì)胞膜表面相互作用，通過毯式模型或孔洞模型殺死真菌［9］。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CGA-N46雖然屬于α螺旋構(gòu)型的多肽，但與常見抗菌肽不同，CGA-N46呈電中性，等電點(diǎn)7.38，不能采用等電點(diǎn)為4.62的cathelicidins家族蛋白的作用機(jī)制［10］，從帶負(fù)電的脂多糖位置處轉(zhuǎn)移陰離子，使細(xì)胞壁發(fā)生紊亂，或與細(xì)胞壁表面帶負(fù)電荷的磷壁酸通過靜電引力結(jié)合，使抗菌肽穿過細(xì)胞壁靠近細(xì)胞質(zhì)膜，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜起作用。也不能通過靜電引力結(jié)合在帶負(fù)電荷的磷脂雙分子膜上，形成柵欄模型、毯式模型或膠束狀結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞膜或細(xì)胞器生物膜達(dá)到抗菌的目的［11］。CGA-N46甘氨酸、脯氨酸含量低，也不會(huì)像脯氨酸含量高達(dá)33%的抗菌肽apidaecin與一種或幾種和蛋白合成相關(guān)的成分結(jié)合并發(fā)揮作用，起到殺菌效果［12］。

CGA-N46為親水性、α螺旋，含有一個(gè)半胱氨酸，可能會(huì)通過形成分子間二硫鍵，如抗菌肽β-defensin-3［13］，通過抑制細(xì)菌或真菌細(xì)胞壁的形成，使細(xì)菌或真菌不能維持正常的細(xì)胞形態(tài)而使其生長受阻，并導(dǎo)致細(xì)胞壁穿孔，最終殺死細(xì)菌或真菌。CGA-N46沒有跨膜區(qū)，為胞漿蛋白。因此，CGAN46可能在細(xì)胞內(nèi)存在靶位點(diǎn)，作用于細(xì)胞內(nèi)某些生物分子，通過影響其結(jié)構(gòu)與功能而起到殺菌作用。

近幾十年來，真菌感染現(xiàn)象已是非常普遍，免疫缺陷病人更甚，其感染真菌的病死率逐年上升。而當(dāng)前，耐藥性是真菌感染性疾病治療面臨的一個(gè)重要問題，即多數(shù)患者對(duì)常規(guī)的抗生素產(chǎn)生了耐藥性［14］。因此，尋找效性好、風(fēng)險(xiǎn)性低的新型抗生素刻不容緩?？咕牟捎貌煌臋C(jī)制殺死真菌而不引起菌體產(chǎn)生耐藥性，被認(rèn)為是傳統(tǒng)抗生素的最優(yōu)替代品［15］。CGA-N46是一種新型抗菌肽，其抗真菌作用機(jī)制也許不止上述預(yù)測(cè)的幾個(gè)方面。因此，闡明CGA-N46的作用機(jī)制還需要通過同位素標(biāo)記、基因缺失等實(shí)驗(yàn)手段，并結(jié)合先進(jìn)的生物物理儀器進(jìn)行分析研究。同時(shí)，CGA-N46的其他生物學(xué)活性還有待進(jìn)一步深入研究。

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