L-抗壞血酸沒食子酸酯的酶催化合成及抗氧化性

范廣璞，劉菊香，劉長春

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安，223003)

沒食子酸(GA)廣泛存在于葡萄、茶葉、五倍花、刺云實(shí)豆莢等植物中，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的藥理作用和較強(qiáng)的抗氧化作用［1-3］，主要用于食品、醫(yī)藥、有機(jī)合成等領(lǐng)域。沒食子酸酯類化合物具有優(yōu)良的抗氧化性能［4］，其中沒食子酸丙脂經(jīng)FAO/WHO組織批準(zhǔn)已用作食品抗氧化劑，其抗氧化性能較BHT(二丁基羥基甲醚)和BHA (丁基羥基茴香醚)等強(qiáng)，耐熱性好，廣泛用于肉腌制品、罐頭制品、魚類制品、餅干、糕點(diǎn)、油脂以及油炸食品等。

L-抗壞血酸(LAA)是一種具有抗氧化作用的水溶性維生素，可用作食品的抗氧化劑、護(hù)色劑等，但是其水溶性限制了它在油脂行業(yè)中的應(yīng)用。L-抗壞血酸酯不僅保持了L-抗壞血酸的抗氧化性能和生理活性，而且在非水體系中的溶解性和穩(wěn)定性均有顯著提高，增加了對自由基的清除能力，已經(jīng)成為一種高效、安全、無毒的抗氧化劑［5］。L-抗壞血酸酯主要通過化學(xué)法和酶法合成?；瘜W(xué)法合成是在濃硫酸、SO42- /ZrO2等催化劑作用下將L-抗壞血酸和羧酸或羧酸酯經(jīng)直接酯化或酯交換得到L-抗壞血酸酯［6-8］，反應(yīng)產(chǎn)率低，環(huán)境污染嚴(yán)重。酶法合成則是采用脂肪酶作催化劑合成L-抗壞血酸酯［9-11］，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物選擇性高，安全無毒。根據(jù)沒食子酸的抗菌性能和較強(qiáng)的抗氧化作用，我們將沒食子酸活性結(jié)構(gòu)單元引入L-抗壞血酸分子中，采用脂肪酶催化合成具有良好脂溶性的L-抗壞血酸沒食子酸酯，并考察了其抗氧化性能，希望獲得一種兼具抑菌活性和抗氧化活性的多功能食品添加劑。

1 材料與方法

1.1 原料

沒食子酸、L-抗壞血酸、4? 分子篩，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;固定化脂肪酶Novozym435，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;其他所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純。

1.2 主要儀器設(shè)備

Nicolet 5-DX 紅外光譜儀，KBr 壓片，美國Nicolet公司;AVANCE 400 核磁共振儀，TMS 作內(nèi)標(biāo)，CDCl3作溶劑，瑞士Bruker 公司;X-4 型顯微熔點(diǎn)儀，北京泰克儀器有限公司;722S 型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 L-抗壞血酸沒食子酸酯的合成

1.3.1.1 合成方法

將沒食子酸1.7 g (10 mmol)、L-抗壞血酸3.5 g(20 mmol)、環(huán)己酮20 mL 和固定化脂肪酶Novozym435 0.25 g 依次加入三口燒瓶中，水浴加熱至50 ℃，攪拌反應(yīng)12 h 后，加入4? 分子篩15 mg 繼續(xù)反應(yīng)12 h。冷卻至室溫，過濾，濾液用飽和食鹽水洗滌(10 mL×3)，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物用環(huán)己烷重結(jié)晶，得到白色固體L-抗壞血酸沒食子酸酯，m. p.155 ～157 ℃。1H NMR(CDCl3)δ:3.55(s，1H，OH)，4.28 ～4.53(m，3H，OCH2，OCH)，5.01(d，1H，COOCH)，5.38(s，3H，ArOH)，6.95 (s，2H，ArH)，11.06(s，2H，= COH);IR(KBr，cm-1)υ:3370，2955，1713，1648，1451，1169。

1.3.1.2 反應(yīng)條件的確定

(1)反應(yīng)溶劑:在沒食子酸10 mmol、L-抗壞血酸20 mmol、脂肪酶0.25 g、50 ℃反應(yīng)24 h 的條件下，分別以甲苯(toluene)、氯仿(chloroform)、叔丁醇(tertbutyl alcohol)、叔戊醇(tert-pentyl alcohol)和環(huán)己酮(cyclohexanone)作溶劑，按1.3.1.1 中方法進(jìn)行試驗。

(2)反應(yīng)物用量:在沒食子酸10 mmol、脂肪酶0.25 g、環(huán)己酮20 mL、50 ℃反應(yīng)24 h 的條件下，改變L-抗壞血酸用量為10、15、20、25 mmol，按1.3.1.1 中方法進(jìn)行試驗。

(3)脂肪酶用量:在沒食子酸10 mmol、L-抗壞血酸20 mmol、環(huán)己酮20 mL、50 ℃反應(yīng)24 h 的條件下，改變脂肪酶用量為0.15、0.20、0.25、0.30 g，按

1.3.1.1 中方法進(jìn)行試驗。

(4)反應(yīng)溫度:在沒食子酸10 mmol、L-抗壞血酸20 mmol、脂肪酶0.25 g、環(huán)己酮20 mL、反應(yīng)24 h 的條件下，改變反應(yīng)溫度為30、40、50、60 ℃，按

1.3.1.1 中方法進(jìn)行試驗。

(5)反應(yīng)時間:在沒食子酸10 mmol、L-抗壞血酸20 mmol、脂肪酶0.25 g、環(huán)己酮20 mL、50 ℃的條件下，改變反應(yīng)時間為12、18、24、30、36 h，按1.3.1.1中方法進(jìn)行試驗。

1.3.2 抗氧化性能的測定

按文獻(xiàn)［12］測定L-抗壞血酸沒食子酸酯對羥基自由基和DPPH 自由基的清除活性，并與L-抗壞血酸的清除活性進(jìn)行比較。

1.3.2.1 清除DPPH 自由基活性測定

將樣品用無水乙醇配制成濃度為1.0 mmol/L 溶液，分別吸取10、20、40、60、80、100 μL 加入1.5 mL離心管中，用無水乙醇稀釋至650 μL，混合均勻后加入0.16 mmol/L DPPH 無水乙醇溶液350 μL，放置30 min，用1 cm 比色皿于517 nm 處測量各樣品溶液(濃度分別為10、20、40、60、80、100 μmol/L)的吸光度(A)。以不含樣品的溶液為空白，根據(jù)測得的吸光度(A)按下式計算目標(biāo)化合物對DPHH 自由基的清除率，平行測定3 次，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。按同樣方法測定L-抗壞血酸對DPHH 自由基的清除率。

1.3.2.2 清除羥基自由基活性測定

將樣品用無水乙醇配制成濃度為50 mmol/L 溶液，然后在1.5 mL 離心管中加入7.5 mmol/L 鄰二氮菲無水乙醇溶液100 μL，7.5 mmo l/L FeSO4水溶液100 μL，樣品溶液分別取20、40、80、120、160、200 μL，體積分?jǐn)?shù)0.1% 的H2O2溶液100 μL，用0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH =7.4)稀釋至1.0 mL。在37 ℃下保溫1 h，用1 cm 比色皿于536 nm 處測定各樣品溶液(濃度分別為1、2、4、6、8、10 mmol/L)的吸光度(A)。以不含樣品的溶液為對照，不含樣品和H2O2的溶液為空白，根據(jù)測得的吸光度(A)計算目標(biāo)化合物對羥基自由基的清除率，平行測定3 次，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。按同樣方法測定L-抗壞血酸對羥基自由基的清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-抗壞血酸沒食子酸酯的合成

在不同的有機(jī)溶劑中脂肪酶的活力差別很大，由于親水性的有機(jī)溶劑會奪取酶周圍微環(huán)境的必需水，導(dǎo)致脂肪酶失活，從而不利于反應(yīng)的進(jìn)行，所以使用疏水性的有機(jī)溶劑較好。不同有機(jī)溶劑對非水介質(zhì)中脂肪酶Novozym 435 催化合成L-抗壞血酸沒食子酸酯的影響結(jié)果見表1。由表1 可知，脂肪酶Novozyme 435 在環(huán)己酮反應(yīng)介質(zhì)中有很好的催化活性，所以環(huán)己酮是酶催化合成L-抗壞血酸沒食子酸酯的最適合有機(jī)溶劑。環(huán)己酮的用量為20 mL 時，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高;環(huán)己酮的用量較少，反應(yīng)中生成的水對反應(yīng)平衡和酶活性的影響較大，使沒食子酸的轉(zhuǎn)化率降低;而環(huán)己酮用量過多，沒食子酸轉(zhuǎn)化率稍有下降，且溶劑回收處理量大;因此環(huán)己酮的適宜用量為20 mL。

表1 溶劑的影響Table 1 Effect of solvent on the yield of conversion rate of gallic acid

圖1 反映了反應(yīng)物用量對沒食子酸轉(zhuǎn)化率的影響?？梢钥闯?，使用過量的L-抗壞血酸有利于反應(yīng)的進(jìn)行，隨著L-抗壞血酸用量的增加，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，但是當(dāng)L-抗壞血酸用量增加到20 mmol 后，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率無顯著增加。

圖1 反應(yīng)物用量對沒食子酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of reactant amount on the conversion rate of gallic acid

圖2 為脂肪酶用量對沒食子酸轉(zhuǎn)化率的影響。由圖2 可知，增加脂肪酶的用量可以增加催化活性中心，使反應(yīng)速度加快，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率得以提高。當(dāng)催化劑用量大于0.25 g，可能是過多的酶使反應(yīng)初始生成的水量增多，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，同時過多的水還會導(dǎo)致酶失活，使沒食子酸的轉(zhuǎn)化率稍有降低。

圖2 脂肪酶用量對沒食子酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of lipase amount on the conversion rate of gallic acid

反應(yīng)溫度對沒食子酸轉(zhuǎn)化率的影響見圖3。從圖3 可以看出，反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響較大。反應(yīng)溫度過低，反應(yīng)不能進(jìn)行完全，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率較低。反應(yīng)溫度過高，由于L-抗壞血酸不穩(wěn)定易氧化，使沒食子酸的轉(zhuǎn)化率下降。所以，適宜反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖4 為沒食子酸轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時間的變化情況。可以看出，延長反應(yīng)時間有利于酶催化反應(yīng)進(jìn)行完全，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率不斷增加。當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到24 h 后，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，沒食子酸的轉(zhuǎn)化率無明顯變化。

2.2 抗氧化活性

圖3 反應(yīng)溫度對沒食子酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the conversion rate of gallic acid

圖4 反應(yīng)時間對沒食子酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of reaction time on the conversion rate of gallic acid

將L-抗壞血酸沒食子酸酯配制成不同的濃度，測定其對DPPH 自由基和羥基自由基的清除活性，并與L-抗壞血酸進(jìn)行比較，結(jié)果見圖5 和圖6。結(jié)果表明，隨著樣品濃度的增加，DPPH 自由基和羥基自由基的清除率均明顯增加。L-抗壞血酸沒食子酸酯濃度為60 μmol/L 時，對DPPH 自由基的清除率為90.3%。L-抗壞血酸沒食子酸酯濃度為8 mmol/L時，對羥基自由基的清除率為92.8%。

圖5 L-抗壞血酸沒食子酸酯對DPPH 自由基的清除活性Fig.5 DPPH radical scavenging activity of L-ascorbyl gallate

應(yīng)用Excel 處理實(shí)驗數(shù)據(jù)，得到試驗樣品清除DPPH 自由基和羥基自由基的模擬方程如下:

L-抗壞血酸沒食子酸酯清除DPPH 自由基的模擬方程為:

圖6 L-抗壞血酸沒食子酸酯對羥基自由基的清除活性Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of L-ascorbyl gallate

式中:y 為清除率，%;x 為濃度，μmol/L。R2=0.9817，計算得IC50=9.97 μmol/L。

L-抗壞血酸清除DPPH 自由基的模擬方程為:

式中:y 為清除率，%;x 為濃度，μmol/L。R2=0.9807，計算得IC50=23.55 μmol/L。

L-抗壞血酸沒食子酸酯清除羥基自由基的模擬方程為:

式中:y 為清除率，%;x 為濃度，mmol/L。R2=0.9956，計算得IC50=2.45 mmol/L。

L-抗壞血酸清除羥基自由基的模擬方程為:

式中:y 為清除率，%;x 為濃度，mmol/L。R2=0.9951，計算得IC50=5.14 mmol/L。

從試驗樣品清除DPPH 自由基和羥基自由基的IC50數(shù)據(jù)可知，L-抗壞血酸沒食子酸酯具有優(yōu)良的抗氧化活性，能有效清除DPPH 自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于對照樣品L-抗壞血酸，清除DPPH自由基能力比清除羥基自由基強(qiáng)。

3 結(jié)論

在固定化脂肪酶Novozym 435 催化下沒食子酸和L-抗壞血酸直接酯化合成了L-抗壞血酸沒食子酸酯，成功地將沒食子酸與L-抗壞血酸兩個活性結(jié)構(gòu)單元結(jié)合在一起。反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物選擇性高，安全無毒，開發(fā)了一種合成新型食品添加劑的新方法?？寡趸詼y試結(jié)果表明，L-抗壞血酸沒食子酸酯可以有效清除DPPH 自由基和羥基自由基，清除效果明顯好于L-抗壞血酸，L-抗壞血酸沒食子酸酯清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50分別為9.97 μmol/L 和2.45 mmol/L，L-抗壞血酸清除DPPH 自由基和羥基自由基的IC50分別為23.55 μmol/L 和5.14 mmol/L。因此，L-抗壞血酸沒食子酸酯是一種潛在的多功能食品添加劑。

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