平歐榛子蛋白分離及功能特性分析*

呂春茂，魏雅靜，孟憲軍，董文軒，陸長穎

(沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽，100866)

榛子，世界四大干果(扁桃、核桃、榛子、腰果)之一。榛仁含脂肪50.6% ～63.8%，蛋白質(zhì)16.2% ～23.6%，碳水化合物16.5%，還含有多種維生素及礦物質(zhì)元素。平歐榛子是以我國野生平榛為母本，歐洲榛為父本進行種間遠源雜交產(chǎn)生的新種，別名大果榛子、雜交榛子。它集中了平榛與歐洲榛的優(yōu)良特性，具有果大、殼薄、出仁率高、適應(yīng)性強、風味好等特點［1］。本研究以平歐榛子為原料，經(jīng)過脫脂處理后分別提取了榛子的分離蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白，并對各蛋白組分分子質(zhì)量分布及分離蛋白的功能特性進行了分析和測定。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

平歐榛子，購于本溪縣三陽大果榛子專業(yè)生產(chǎn)合作社。榛子去殼、脫皮、粉碎、脫脂、分裝(50 g/袋)，于-20℃冰箱中備用;SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、預染蛋白Maker，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;大豆色拉油，市售;核桃，市售;HCl、NaOH、Cu-SO4、NaCl、乙醇、正己烷，均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

FD-IC-80 真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHB-ⅢA 循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;pHS-25 數(shù)顯pH 計，上海精密科學儀器有限公司;DYY-6C 型電泳儀，北京市六一儀器廠;Mini-PROTEAN Tetra System 電泳槽，BIO-RAD 公司;TDL-40B 臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;IKA T18 ULTRA-TURRAX 高速分散均質(zhì)機，IKA 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基本營養(yǎng)成分測定

粗蛋白測定:微量凱氏定氮法(GB/T5009.5 -2010);粗脂肪測定:索氏提取法(GB/T 14772 -2008);水分測定:常壓干燥法(GB/T5009.5 -2010);灰分測定:高溫灼燒法(GB/T5009.4 -2010)。

1.3.2 榛子蛋白分離方法

榛子分離蛋白的制備采用堿溶酸沉法，見參考文獻［2-3］。

參照Osborne 蛋白分級法［4］，分級提取制備榛子的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白，計算各蛋白所占的相對百分比。

1.3.3 SDS -PAGE 分析蛋白相對分子質(zhì)量

根據(jù)文獻［6-7］，采用12%分離膠、5%濃縮膠對分離得到的各榛子蛋白組分進行SDS -PAGE 電泳分析。穩(wěn)流操作，考馬斯亮藍R-350 染色15 min，10%冰醋酸脫色，拍照。

1.3.4 榛子分離蛋白功能特性的測定

1.3.4.1 溶解度［7］

測定不同pH 值下樣品的氮溶解性指數(shù)NSI 值。制備0.1 g/L 榛子蛋白溶液，用0.1 mol/L HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為2 ～9，室溫下攪拌1 h，4 000 r/min 離心10 min，分別測定上清液中含氮量及樣品中總氮含量。溶解度的計算:

1.3.4.2 持水性［8］

準確稱取1 g 榛子蛋白于預先稱量過的離心管中，加入30 mL 去離子水，用磁力攪拌器攪拌使其混合均勻，調(diào)pH 值為3、5、7、9，將裝有樣液的離心管分別放在30、50、70、90 ℃的水浴中加熱30 min，然后于冷卻水中冷卻30 min，3 000 r/min 離心10 min，去除上清液，稱重。若無上清液，則應(yīng)加水攪拌再離心，直到有少量上清液為止。持水性的計算:

1.3.4.3 吸油性［9］

準確稱取0.5 g 榛子蛋白于離心管中，加入3 mL大豆色拉油，在高速分散均質(zhì)機中均質(zhì)2 min，分別在30、50、70、90 ℃的水浴中靜止30 min，1 000 r/min 離心沉降25 min，吸取上層未吸附油，稱量。吸油性的計算:

吸油性=(吸油后樣品和離心管總質(zhì)量-吸油前樣品和離心管總質(zhì)量)/樣品質(zhì)量

1.3.4.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性［10］

制備0.1、0.3、0.5 g/L 榛子蛋白溶液各25 mL，分別調(diào)pH 值為3、5、7、9，加入25 mL 大豆色拉油，在高速分散均質(zhì)機中均質(zhì)2 min，1 500 r/min 離心5 min，測定此時離心管中乳化層的高度和液體總高度。然后將離心管置于80℃水浴中，加熱30 min，冷卻至室溫，再離心(1 500 r/min)5 min，測出此時乳化層高度。乳化性和乳化穩(wěn)定性的計算公式如下:

1.3.4.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性［11］

制備0.1、0.3、0.5 g/L 榛子蛋白溶液各100 mL，分別調(diào)pH 值為3、5、7、9，在高速分散均質(zhì)機中均質(zhì)2 min，記下均質(zhì)停止時泡沫體積，靜置30 min，記下此時泡沫體積。起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計算:

2 結(jié)果與討論

2.1 平歐榛子基本營養(yǎng)組成

平歐榛子基本營養(yǎng)組成見表1。

表1 榛子原料、脫脂粉主要成分分析 %Table 1 Main composition of the hazelnut kernel and defatted powder %

2.2 榛子不同類型蛋白質(zhì)組成

由圖1 可知，榛子蛋白質(zhì)中清蛋白含量最高，其次為球蛋白，谷蛋白含量較低，醇溶蛋白含量最低。由于榛子主要的蛋白質(zhì)組分是水溶性的清蛋白和鹽溶性的球蛋白，因此溶解性能較好，這也是蛋白質(zhì)主要的功能性質(zhì)，可以作為一種理想的天然的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源應(yīng)用于食品工業(yè)中。

圖1 榛子蛋白質(zhì)組分的構(gòu)成及含量Fig.1 Distribution and protein content of protein frations of hazelnut

2.3 榛子蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布

采用12%的分離膠，5%濃縮膠對榛子蛋白分離出的組分進行SDS-PAGE 電泳分析，如圖2、圖3 所示。從圖2 可以看出，在非還原條件下，分離蛋白及4 種分提蛋白的相對分子質(zhì)量均小于71 kDa，分離蛋白主要亞基分布在35 ～71 kDa，此外，還有一些含量較少的亞基分布在16 kDa 附近。4 種分提蛋白質(zhì)的亞基分布也存在一定差異，清蛋白在71 kDa 處有1條明顯的亞基帶，在35 ～71 kDa 還有5 條較模糊的亞基帶，在16 kDa 附近有一些相對分子質(zhì)量較低的亞基，球蛋白在50 ～71 kDa 有2 條比較明顯的亞基帶，在35 ～50 kDa 有3 條比較明顯的亞基帶，在16 kDa 附近有含量較少的亞基，谷蛋白在16 ～25 kDa有含量較少的亞基，醇溶蛋白在71 kDa 附近有1 條很淺的亞基帶。

圖2 非還原SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.2 Non-reduced SDS-PAGE

從圖3 可以看出，在還原條件下，分離蛋白及4種分提蛋白的相對分子質(zhì)量也均小于71 kua，在16～50 kua 之間均有2 條主要亞基帶，在16 ～25 kua之間均有一條明顯條帶，分離蛋白和清蛋白在50 kua附近還有一條比較明顯的亞基帶，而球蛋白在50 kua附近亞基帶較淺，谷蛋白在50 kua 附近沒有條帶，醇溶蛋白在25 kua 附近和35 ～50 kua 之間分別有一條很淺的亞基帶。圖3 與圖2 的差異還表明榛子蛋白中存在分子內(nèi)及分子間二硫鍵。

圖3 還原SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.3 Reduced SDS-PAGE

2.4 溶解度

在室溫條件下，考察不同pH 值對榛子分離蛋白溶解度的影響，如圖4 所示，榛子分離蛋白溶解度隨pH 值的變化曲線呈2 種不同的趨勢。pH5 時，蛋白的溶解度最低，這是由于在pH 值接近該蛋白等電點時，蛋白質(zhì)分子的正負電荷逐漸相等，表面的凈電荷幾乎為零，分子間斥力最小，蛋白質(zhì)容易凝聚形成沉淀［12］。

2.5 持水性

圖4 不同pH 值下榛子分離蛋白的溶解性Fig.4 Dissolve characteristics of protein isolate of hazelnut on different pH value

在食品加工中，蛋白質(zhì)對原料中的水分以及添加到產(chǎn)品中參與加工的水分具有的保持能力，就是蛋白質(zhì)的持水性。持水性的高低直接決定著產(chǎn)品的風味、質(zhì)地和組成狀態(tài)［13］。本研究考察了不同溫度、pH 值對榛子分離蛋白持水性的影響。由圖5 可知，pH5 在等電點附近，持水性最小，當pH ＜5 時，持水性隨酸性增強而增大，當pH ＞5 時，持水性隨堿性增強而增大;從溫度看，隨溫度的升高，分子熱運動加劇，水在蛋白質(zhì)中分布的更均勻，氫鍵減少或蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)表面積減小導致持水性下降，繼續(xù)加熱，使埋藏在球狀分子內(nèi)部的極性側(cè)鏈發(fā)生離解和開鏈轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)分子表面，蛋白持水性又表現(xiàn)為增大［14］。

圖5 不同pH 值、溫度下榛子分離蛋白的持水性Fig.5 Water-holding of protein isolate of hazelnut on different pH value and temperature

2.6 吸油性

蛋白質(zhì)的吸油性是指蛋白產(chǎn)品吸附油脂的能力。如圖6 所示，當溫度升至50℃左右時，榛子分離蛋白的吸油性最低為2.815 g/g，該值比山核桃蛋白質(zhì)的吸油性高(50℃，1.89 g/g)［15］，但小于核桃分離蛋白，這可能是由于隨著溫度升高，油的黏度逐漸降低，蛋白對油的吸附力減小，使得分離蛋白的吸油性下降。隨著溫度繼續(xù)上升，蛋白質(zhì)變性加劇，疏水基團暴露，與油的親和力加大。除溫度外，蛋白質(zhì)的pH值、種類、加工方法等都會影響到蛋白質(zhì)的吸油性。

圖6 不同溫度下榛子分離蛋白、核桃分離蛋白的吸油性Fig.6 OAC of protein isolate of hazelnut and walnut on different temperature

2.7 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性是衡量蛋白質(zhì)促進水型乳狀液形成能力的指標，乳化穩(wěn)定性是指維持乳狀液的能力［16］。蛋白質(zhì)分子中既有親水集團又有疏水集團，因此，在水-油界面處，能與水及油分別結(jié)合，形成水油混合液。如圖7、圖8 所示，榛子分離蛋白在接近等電點區(qū)域乳化性和乳化穩(wěn)定性最低，在等電點區(qū)域左側(cè)時，蛋白質(zhì)乳化性隨pH 值的升高而降低，在等電點區(qū)域右側(cè)時，蛋白質(zhì)乳化性隨pH 的升高而升高。這是因為在等電點區(qū)域，蛋白質(zhì)發(fā)生絮凝，溶解度最小，而偏離此區(qū)域蛋白質(zhì)溶解度較大，這說明蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)與蛋白質(zhì)溶解性密切相關(guān)。同時，由于蛋白質(zhì)在乳化體系中的穩(wěn)定性取決于界面膜的穩(wěn)定性，隨著蛋白質(zhì)濃度的增大，界面膜厚度增加，從而提高了膜的強度，增加了蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性。

圖7 不同濃度、pH 值下榛子分離蛋白的乳化性Fig.7 Emulsifiability property of protein isolate of hazelnut on different concentration and pH value

圖8 不同蛋白質(zhì)濃度、pH 值下榛子分離蛋白的乳化穩(wěn)定性Fig.8 Emulsion stability of protein isolate of hazelnut on different concentration and pH value

2.8 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

水分子對空氣的包裹形成氣泡，蛋白質(zhì)作為兩性分子可以成為水-氣表面的介質(zhì)，幫助降低氣-液表面張力促成泡沫形成［17］。在泡沫形成后，蛋白質(zhì)肽鏈通過分子內(nèi)及分子間相互作用，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，維護泡沫穩(wěn)定。由圖9 可見，蛋白質(zhì)起泡性曲線呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在等電點區(qū)域，蛋白質(zhì)的溶解性很差，而起泡性與溶解度密切相關(guān)，導致此時起泡性最低，偏離等電點的pH 環(huán)境下溶解性增強，因此吸附到氣-液界面上的蛋白質(zhì)分子較多，從而起泡性增強。由圖10 可見，蛋白質(zhì)泡沫穩(wěn)定性曲線呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，等電點區(qū)域出現(xiàn)極大點，這是因為此時泡沫處于破裂非常緩慢階段，泡沫排液和pH 值有很大的關(guān)系，在等電點附近，排液速度減慢，因此泡沫穩(wěn)定。如圖9、圖10 所示，蛋白質(zhì)的起泡性及泡沫穩(wěn)定性均隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增大，蛋白質(zhì)濃度提高有利于形成較小、較硬的氣泡，有利于產(chǎn)生氣泡和泡沫的穩(wěn)定。

圖9 不同蛋白質(zhì)濃度、pH 值下榛子分離蛋白的起泡性Fig.9 Foamability of protein isolate of hazelnut on different concentration and pH value

3 結(jié)論

(1)平歐榛子基本營養(yǎng)組成，蛋白質(zhì)22.74%，脂肪58.82%，水分5.17%，灰分4.61%，蛋白質(zhì)組分分析結(jié)果表明清蛋白占榛子粗蛋白的67.18%，球蛋白17.62%，谷蛋白6.53%，醇溶蛋白3.17%。清蛋白是構(gòu)成榛子蛋白組成的主要部分，含量超過了60%。

圖10 不同蛋白質(zhì)濃度、pH 值下榛子分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性Fig.10 Foam stability of protein isolate of hazelnut on different concentration and pH value

(2)榛子蛋白組分相對分子質(zhì)量分布比較集中，且各組分間存在相似之處，還原和非還原SDS-PAGE分析表明，榛子蛋白質(zhì)各種組分中均存在二硫鍵，非還原條件下，各組分亞基相對分子質(zhì)量主要分布在35 ～71 kDa，還原條件下，各組分亞基相對分子質(zhì)量主要分布在16 ～50 kDa，并且有2 條明顯的亞基帶，醇溶蛋白的亞基帶很淺。

(3)榛子分離蛋白的溶解性在pH5 時最小;在溫度為50℃，pH9 的條件下持水性最好;其吸油性在溫度為50℃時最小，為2.815 g/g;乳化性在濃度為0.5 g/L 時最大，同時濃度越高越有利于保持乳化穩(wěn)定性;其起泡性和泡沫穩(wěn)定性也隨濃度的上升而升高。

［1］ 劉國夫，殷展波，李延波，等. 平歐雜交榛子引種栽培技術(shù)［J］. 中國園藝文摘，2009，25(5):113 -114.

［2］ 張春紅，盛芳，宋曉藝. 榛子分離蛋白提取及其功能特性的研究［J］. 油料蛋白，2011，8 (36):28 -30.

［3］ 娜仁圖雅. 紅小豆分離蛋白的特性研究以及抗氧化肽制備［D］. 內(nèi)蒙古:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2011:9 -10.

［4］ Idouraine A，Yensen S B，Weber C W. Fraction and parial characterization of tepary bean (Phaseolus acutifolius)prorein［J］. Food Chemistry，1994，50(1):13 -18.

［5］ 楊令葉. 韓城大紅袍花椒籽種仁蛋白質(zhì)分離提取和性能的研究［D］. 西安:陜西師范大學，2011:17 -18.

［6］ Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］. Nature，1976，1(227):681 -185.

［7］ Semiu O O，F(xiàn)olake O H，Hans-pater M，et al. Functional properties of protein concentrates and isolates produced from cashew(Anacardium occidentale L. )nut［J］. Food Chemistry，2009，3(115):852 -858.

［8］ 朱凱艷. 利用水相同時提取花生油和蛋白工藝的研究［D］. 無錫:江南大學，2012:17 -18.

［9］ 黃曉鈺，劉鄰渭. 食品化學綜合實驗［M］. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2002:122 -12.

［10］ Dipak K Dev.Funtional properties of rapeseed protein products with varying phytic acid content［J］. Agri Food Chem，1986，34:775.

［11］ 杜蕾蕾. 冷榨核桃制備核桃油和核桃蛋白的研究［D］. 武漢:武漢工業(yè)學院，2009:48 -49.

［12］ 管斌，林洪，王廣策. 食品蛋白質(zhì)化學［M］. 北京:化學工藝出版社，2000:2 -6.

［13］ 李劍玄. 滸苔蛋白質(zhì)的分離提取及其功能特性的研究［D］. 武漢:武漢工業(yè)學院，2010:33 -34.

［14］ 何東平. 水相酶法同步提取冷榨花生餅中蛋白質(zhì)和花生油的研究［D］. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學，2006:55 -56.

［15］ 何志平. 浙江山核桃抗氧化與蛋白質(zhì)特性研究［D］.杭州:浙江大學，2011:82 -83.

［16］ 段家玉. 冷榨花生餅制備花生蛋白和多肽的研究［D］. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學，2006:30 -31.

［17］ 李迎秋，陳正. 高壓脈沖電場對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響［J］. 農(nóng)業(yè)工程學報，2006，22(8):194 -198.