啤酒花黃酮的純化工藝及其工藝參數(shù)的優(yōu)化

任治興，王 玲，潘志勇，孫 新，盧日峰（.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春 300；.吉林省人民醫(yī)院營養(yǎng)科，吉林 長春 300）

啤酒花（Humulus lupulus）學(xué)名為蛇麻、蛇麻花、唐草花等，是?？迫劜輰俾薷试荼局参铮?］。啤酒花作為一種使用歷史悠久的藥食同源植物，成分復(fù)雜，含有十余類化學(xué)物質(zhì)，包括樹脂類、揮發(fā)油、黃酮類、鞣質(zhì)、膽堿、粗纖維和氨基酸等多種化學(xué)成分［2］。我國的啤酒花資源豐富，總產(chǎn)量處于世界領(lǐng)先地位。啤酒花具有抗結(jié)核、安神利尿和健胃消食等功效［3］。目前，啤酒花的用途單一，主要用以啤酒的釀造工業(yè)，而在其他方面的用途卻未能得到充分的利用。啤酒花有效成分的分離提取對拓展啤酒花的藥用價值，特別是啤酒花在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要的意義。啤酒花中黃酮含量為6%～8%，其中主要有查耳酮、黃酮和黃烷等3類［4］。國內(nèi)外關(guān)于啤酒花黃酮純化工藝的研究報道較少。本研究以啤酒花為原料對黃酮類物質(zhì)進(jìn)行分離純化，并優(yōu)化工藝參數(shù)，為啤酒花黃酮類化合物的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 啤酒花、主要試劑和儀器

啤酒花購于新疆保潤農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，經(jīng)鑒定為大麻科葎草屬植物啤酒花的雌花序。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于中國藥品生物檢定所，生產(chǎn)批號：100080－200707，規(guī)格：供實驗室藥品檢驗用；D101大孔吸附樹脂購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；FL－2和FL－3大孔樹脂購于天津歐瑞生物科技有限公司；UV－2550紫外可見分光光度計購于日本島津公司。

1.2 啤酒花黃酮的浸提

精密稱取適量啤酒花按1︰20分別加入30%、40%、50%、60%和70%的乙醇溶液，60℃加熱回流2h，趁熱抽濾，重復(fù)1次，濾液合并，備用。根據(jù)浸提效果確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3 啤酒花黃酮的純化

1.3.1 不同大孔樹脂對啤酒花黃酮的吸附及洗脫

取預(yù)處理的D101、FL－2和FL－3共3種樹脂各5.0g，分別加入pH值為7的啤酒花提取液，25℃、恒溫振蕩24h，轉(zhuǎn)速為110r·min－1，測定上清液的黃酮含量，計算不同樹脂的靜態(tài)吸附率。將吸附飽和的樹脂濾出，用蒸餾水洗滌1次，吸干樹脂表面水分，加入70%乙醇溶液40mL，25℃、恒溫振蕩24h，轉(zhuǎn)速為110r·min－1，測定上清液的黃酮含量，計算黃酮的洗脫率。

1.3.2 FL－3大孔樹脂對啤酒花黃酮的吸附 ①吸附液最佳乙醇濃度的確定：分別稱取FL－3樹脂4份，每份5g，置于具塞錐形瓶中，再分別加入pH＝7、乙醇濃度分別為10%、20%、30%和40%的啤酒花提取液50mL，25℃、恒溫振蕩24h，轉(zhuǎn)速為110r·min－1，取出上清液測定黃酮含量，計算樹脂靜態(tài)吸附率。吸附率＝（吸附前上清液黃酮濃度—吸附平衡后上清液黃酮濃度）／吸附前上清液黃酮濃度×100%。② 吸附液最佳pH值的確定：分別稱取FL－3樹脂6份，每份5g，置于具塞錐形瓶中，再分別加入乙醇濃度為20%、pH值為4、5、6、7、8和9的啤酒花提取液50mL，25℃恒溫振蕩24h，轉(zhuǎn)速為110r·min－1，取出上清液測定黃酮含量，計算樹脂靜態(tài)吸附率，吸附率計算公式同上。

1.3.3 啤酒花黃酮的洗脫 ①洗脫劑最佳乙醇濃度的確定：精密量取啤酒花提取液5份，每份50mL，分別用5g樹脂吸附達(dá)到飽和，蒸餾水洗滌1次，吸干樹脂表面水分。再分別加入40%、50%、60%、70%和80%乙醇溶液40mL，25℃恒溫振蕩24h，轉(zhuǎn)速為110r·min－1，去上清液測定黃酮含量，計算樹脂洗脫率。洗脫率＝洗脫液中黃酮濃度／（吸附前上清液黃酮濃度×吸附率）×100%。②洗脫劑最佳pH值的確定：精密量取啤酒花提取液6份，每份50mL，分別用5g樹脂吸附達(dá)到飽和，蒸餾水洗滌1次，吸干樹脂表面水分。再分別加入pH值為4、5、6、7、8和9的60%乙醇溶液40mL，25℃恒溫振蕩24h，轉(zhuǎn)速為110r·min－1，取上清液測定黃酮含量，計算樹脂洗脫率，洗脫率計算公式同上。

1.4 黃酮含量的測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程的確定［5］精密稱取105℃條件下干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg置50mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，搖勻，即得0.2g·L－1蘆丁儲備液。分別吸取蘆丁儲備液0、1、2、3、4、5和6mL于25mL容量瓶中，加60%乙醇補充至6mL，加5%亞硝酸鈉1mL搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%氫氧化鈉溶液10mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以60%乙醇作空白參比液，在500nm下測吸光度（A）值，以蘆丁濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：A＝14.5710C＋0.0053（r＝0.9997），線性范圍為8～48mg·L－1。

1.4.2 樣品的測定 精密稱取浸提液3mL置25mL容量瓶中，參照1.4.1中蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法繪制樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品溶液的濃度以及黃酮含量。

1.5 紫外光譜的測定

精密稱取樣品 ，用甲醇定容至0.04g·L－1的溶液，然后以UV－2550紫外可見分光光度計測定［6］，以甲醇作參比液，掃描波長范圍為200～600nm。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度乙醇作用下啤酒花黃酮的浸取效果

乙醇濃度在30%～40%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，浸提液中黃酮的含量由1.31g·L－1逐漸增加到1.93g·L－1；乙醇濃度在40%～70%范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，浸提液中黃酮的含量由1.93g·L－1減少到1.02g·L－1。見圖1。本實驗選擇體積分?jǐn)?shù)為40%乙醇浸提啤酒花黃酮。

圖1 不同濃度乙醇作用下啤酒花黃酮的浸提效果Fig.1 Extraction efficacy of total hops flavonoids after treated with different concentrations of ethanol

2.2 大孔樹脂型號的選擇

D101、FL－2和FL－3樹脂對啤酒花黃酮的靜態(tài)吸附和洗脫效果：D101大孔樹脂的吸附率與洗脫率分別為82.2%和83.6%，F(xiàn)L－2大孔樹脂的吸附率與洗脫率分別為45.5%和84.9%，F(xiàn)L－3大孔樹脂的吸附率與洗脫率分別為94.2%和97.7%。在相同實驗條件下，F(xiàn)L－3樹脂的吸附率和洗脫率最高。綜合比較3種大孔樹脂的吸附率和洗脫率，本實驗選擇FL－3樹脂對啤酒花黃酮進(jìn)行純化。

2.3 不同濃度乙醇作用下樹脂的吸附率

乙醇濃度在10%～30%范圍內(nèi)，乙醇濃度的變化對吸附率的影響不大。當(dāng)乙醇濃度大于30%時，隨著乙醇濃度的增加，樹脂的吸附率由79.2%降到29.4%，下降趨勢明顯。見圖2。本實驗選用體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇溶液進(jìn)行吸附。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇作用下樹脂的吸附率Fig.2 Absorption efficacy of tota hopsl flavonoids after treated with different concentrations of ethanol

2.4 不同pH值20%乙醇溶液作用下的啤酒花黃酮的吸附率

20%乙醇溶液pH值在4～8范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，吸附率由88.6%降到62.7%。當(dāng)pH值大于8時，隨著pH值的增加，吸附率略有增加。見圖3。本實驗采用pH值為4的20%乙醇溶液進(jìn)行吸附。

圖3 不同pH值的20%乙醇溶液作用下啤酒花黃酮的吸附率Fig.3 Absorption efficacy of total flavonoids from hops after treated with 20%ethanol with different pH values

2.5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇作用下啤酒花黃酮的洗脫率

乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫率由60.9%逐漸增加到81.8%。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，洗脫率反而由81.8%下降到73.9%。見圖4。本實驗采用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液為洗脫液。

2.6 不同pH值60%乙醇溶液作用下啤酒花黃酮的洗脫率

在pH值為4～7范圍內(nèi)，隨著洗脫液pH值的增加，洗脫率由38.7%逐漸增加到64.9%，當(dāng)pH值大于7時，洗脫率由64.9%下降到45.4%。見圖5。本實驗采用pH值為7的60%乙醇溶液作為洗脫液。

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇作用下啤酒花黃酮的洗脫率Fig.4 Elution efficacy of total flavonoids from hops after treated with different concentrations of ethanol

圖5 不同pH值的60%乙醇溶液作用下啤酒花黃酮的洗脫率Fig.5 Elution efficacy of total flavonoids from hops after treated with 60%ethanol with different pH values

2.7 啤酒花黃酮的紫外光譜特性

紫外光譜掃描結(jié)果顯示：啤酒花黃酮在375nm處有1個很平緩的肩峰，在277nm處有明顯的吸收峰。見圖6。

圖6 啤酒花黃酮的紫外光譜掃描Fig.6 UV Spectra scan of total flavonoids from hops

3 討 論

黃酮類化合物（flavonoids）又稱黃酮體、黃堿素和類黃酮，是廣泛存在于自然界的一大類化合物。黃酮類化合物在植物體內(nèi)大部分與糖成苷，一部分以苷元存在。不同結(jié)構(gòu)類黃酮的溶解性存在很大差異，苷類極性比苷元強。由于黃酮、黃酮醇和查耳酮等分子間引力較大，難溶于水。根據(jù)相似相溶原理，對于極性較大物質(zhì)的提取，應(yīng)該選用極性較大的溶劑［7－8，13］，因此本實驗用乙醇作為提取劑提取啤酒花總黃酮，并采用大孔樹脂靜態(tài)吸附和洗脫方式對啤酒花總黃酮進(jìn)行了純化。

何文靜等［5］用超聲波法提取啤酒花黃酮時發(fā)現(xiàn)：影響啤酒花黃酮的提取因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間。從本研究結(jié)果可以看出，提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)是影響提取效果的主要因素。因此本實驗在固定料液比為1∶20，提取時間2h的條件下考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響，結(jié)果表明：最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，該條件下每克啤酒花最高可獲77mg黃酮。

在所考察的3種大孔樹脂中，F(xiàn)L－3大孔吸附樹脂對啤酒花黃酮的吸附率與洗脫率均高于其他大孔樹脂，可能其結(jié)構(gòu)有利于啤酒花黃酮的吸附。由于黃酮類化合物中大多數(shù)含有酚羥基［3，9，13－14］，本實驗結(jié)果顯示：改變吸附液和洗脫液的pH值對大孔樹脂吸附及洗脫效果有明顯影響。黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定本身呈弱酸性，因此要達(dá)到較好的吸附效果，必須在弱酸性或酸性條件下吸附。洗脫液pH值的升高可促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的離子化，增加黃酮類物質(zhì)在洗脫液中的溶解度，同時黃酮類物質(zhì)的水解也加劇，母核被氧化成醌類化合物［15－16］。本研究結(jié)果表明：pH值為4的吸附液吸附效果最好，pH值為7的洗脫液的洗脫吸附效果最好。吸附液和洗脫液的乙醇濃度對吸附率和洗脫率也有一定的影響，這可能與不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液中黃酮的溶解度變化有關(guān)。乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%～30%范圍內(nèi)黃酮的溶解度較低，有利于黃酮的吸附，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%時黃酮的溶解度較高，有利于黃酮的洗脫。

紫外可見吸收光譜法是一種很常用的鑒定化合物的方法［6］。大多數(shù)黃酮類化合物甲醇溶液的紫外吸收光譜由2個主要吸收帶組成，出現(xiàn)在300～400nm和240～280nm［11］。純化樣品在375nm處有一個很平緩的肩峰，在277nm處有一個很明顯的吸收峰，符合黃酮類化合物的紫外吸收光譜特性。

李專等［17］采用聚酰胺樹脂柱層析純化啤酒花CO2萃余物中的黃酮，再用70%乙醇洗脫，得到的樣品中黃酮含量為62.2%。本實驗采用40%乙醇浸提，F(xiàn)L－3大孔樹脂靜態(tài)吸附的方式，最終得到的樣品中黃酮含量為70.6%，收率為70.2%，達(dá)到了相同的分離純化效果。本工藝由于采用了靜態(tài)吸附的方式，具有操作簡便、樣品處理量大、樹脂易于再生等優(yōu)點。啤酒花中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點及其藥理作用方面有待進(jìn)一步的研究。

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