• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鹽溶法構建磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型方法的建立及評價

    2013-11-30 01:08:42魏小蘭陳婷梅
    關鍵詞:顱骨植骨氣囊

    劉 銘,魏小蘭,陳婷梅,姜 蓉,張 健

    (1.安康職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院,陜西 安康725000;2.重慶醫(yī)科大學檢驗系 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室, 重慶400016; 3.重慶醫(yī)科大學干細胞與組織工程研究室免疫組織化學室,重慶400016; 4.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科,重慶400016)

    鹽溶法構建磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型方法的建立及評價

    劉 銘1,魏小蘭1,陳婷梅2,姜 蓉3,張 健4

    (1.安康職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院,陜西 安康725000;2.重慶醫(yī)科大學檢驗系 臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室, 重慶400016; 3.重慶醫(yī)科大學干細胞與組織工程研究室免疫組織化學室,重慶400016; 4.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科,重慶400016)

    目的:探討構建新型磨損顆粒誘導的骨溶解模型,為研究人工關節(jié)無菌性松動提供簡單、方便的實驗動物模型。方法:制備無菌鹽包埋磨損顆粒;采用隨機數(shù)字表法將50只BALB/c小鼠分為空白對照組、純鹽組、氣囊植骨組和鹽包埋磨損顆粒組,其中氣囊植骨組20只,其他各組10只;氣囊植骨組小鼠術后21 d,余3組術后14 d獲取小鼠顱骨組織標本,HE染色觀察炎細胞滲出量和骨溶解面積;掃描電鏡觀測骨片吸收陷窩面積百分比;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測破骨細胞增殖分化。結果:HE染色,與空白對照組和純鹽組比較,氣囊植骨組和鹽包埋磨損顆粒組小鼠的炎性細胞滲出量、骨溶解面積明顯增大(Plt;0.01);與氣囊植骨組比較,鹽包埋磨損顆粒組小鼠TRAP染色破骨細胞數(shù)量明顯增多(Plt;0.01);掃描電鏡觀察,鹽包埋磨損顆粒組小鼠骨片吸收陷窩面積百分比顯著高于氣囊植骨組(Plt;0.01)。結論:鹽溶法是一種簡單、經(jīng)濟、快速準確的構建小鼠顱骨溶解模型方法,能夠真實模擬人工關節(jié)松動發(fā)生的病理過程。

    磨損顆粒;顱骨溶解;無菌松動;氣囊植骨;小鼠,近交BALBc

    人工關節(jié)置換術是治療嚴重關節(jié)疾患、重塑關節(jié)功能的重要手段。隨著關節(jié)置換例數(shù)的增多,假體無菌松動的問題日趨嚴重,二次翻修治療給廣大患者帶來嚴重的經(jīng)濟和精神創(chuàng)傷[1]。任何通過有效的非手術方式來預防和治療人工關節(jié)無菌性松動一直是關節(jié)外科的研究熱點。目前研究[2]顯示:導致無菌性關節(jié)松動的主要原因是磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解。無論目前使用藥物還是靶向干預磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解現(xiàn)象,首先需建立簡單、快捷、經(jīng)濟、方便、實用性強的動物模型。目前國內(nèi)外學者使用最多的是氣囊植骨模型,該造模缺少神經(jīng)血供營養(yǎng)支持,不能真實模擬磨損顆粒在體內(nèi)誘導溶骨的真實環(huán)境,也不能真實反映骨組織在重建過程中成骨細胞的修復和破骨細胞的溶骨的動態(tài)平衡。本實驗根據(jù)鹽溶解理化特性,首次采用鹽結晶攜帶聚乙烯磨損顆粒置入部分祛除小鼠顱骨外膜的顱頂處,建立無菌松動病理模型。通過2種建模方法的比較,探討其可行性,為人工關節(jié)松動的研究提供簡潔的動物模型。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 實驗選用50只近交系雌性 BALB/c 小鼠, 年齡 8~10 周,體質(zhì)量18~20 g,由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2007-0001,使用許可證號:SYXK(渝)2007-0001。 TRAP 試劑盒購于南京建成公司;聚乙烯微粒購于美國 Zimmer 公司, 微粒直徑為2~3 μm。BX-50光學顯微鏡購于日本Olympus公司,S-3000N掃描電鏡購于日本日立公司,LEICA RM2135石蠟切片機購于德國Leica公司。

    1.2 鹽結晶攜帶聚乙烯磨損顆粒的制備 5%的氯化鈉溶液2 mL,加入20 mg高分子聚乙烯顆粒,充分混合,制成10 g·L-1濃度的鹽溶液。在常溫無菌環(huán)境下(超凈臺)自然蒸發(fā)5~7 d,鹽溶液結晶。搗碎后制成鹽包埋磨損顆粒結晶體,在電子秤上分別稱出10包(51 mg/包)鹽包埋聚乙烯磨損顆粒和純鹽晶體待置。

    1.3 小鼠顱骨溶解模型的制備 30只清潔無菌小鼠隨即分為空白對照組、純鹽組和鹽包埋磨損顆粒組,每組10只,稱取質(zhì)量并標記。制備4%水合氯醛,按照100 g·L-1體質(zhì)量進行腹腔麻醉,麻醉成功后,小鼠頭部用脫毛劑充分脫毛后碘伏常規(guī)消毒,鋪一次性無菌巾,在小鼠顱頂矢狀線 (垂直于小鼠雙側外耳道連線,并經(jīng)過該連線的中點)用15號小圓刀或者小剪刀切開1 cm左右皮膚及皮下組織。在助手成功對小鼠頭部皮膚牽引下,充分暴露小鼠顱頂約1 cm×1 cm范圍完整骨膜。在顱頂處,用小圓刀輕輕剝離或者15號小鑷子輕輕撕脫小鼠顱骨外膜,形成0.2 cm×0.2 cm骨膜缺損區(qū)(一般無出血,有少量出血時,用無菌紗布輕拭即可)。其中空白對照組用消毒微量取樣槍吸取5%生理鹽水50 μL,滴入骨膜缺損區(qū)即可;純鹽組放入無菌鹽顆粒51 mg,鹽包埋磨損顆粒組放入51 mg鹽包埋磨損顆粒結晶體。各組在放置鹽結晶物或者純鹽顆粒時,應盡量均勻放置在骨膜缺損區(qū),然后用無菌、無損傷線縫合傷口。在整個手術過程中,小鼠眼睛用無菌紅霉素眼膏保護。模型構建成功,待小鼠麻醉清醒后分籠飼養(yǎng)。術后常規(guī)給予青霉素抗炎2 d,預防感染。術后14 d分別處死各組小鼠,無菌環(huán)境下取顱骨頂處骨組織(此項操作中要求取出的顱頂骨以正中矢狀線為中心的環(huán)形區(qū)域)。取出的標本用PBS液沖洗,10%中性甲醛固定24 h, 10%中性EDTA脫鈣液脫鈣 14 d,蒸餾水沖洗,70%酒精固定、石蠟包埋,切片機連續(xù)3層切片, 層厚6 μm用于HE、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。電鏡掃描:小鼠顱骨標本用生理鹽水沖洗3次,4%戊二醛固定送入電鏡室專業(yè)處理。氣囊植骨模型按照文獻[3]步驟構建,術后第21天用頸椎脫位法處死小鼠,將氣囊完整摘除,原位采集氣囊和顱骨余組織,保護軟組織和顱骨界面不受破壞,其他步驟同前。

    1.4 HE染色檢測骨溶解面積和骨膜炎性反應細胞 選定切片,行常規(guī)HE染色,在 10×、20×和40× 條件下觀察顱頂骨膜炎性反應和顱骨的表面侵蝕情況, 每組選用 3個標本進行觀察,每個標本采集 5個不同的視野,采用 Image ProPlus 6.0(IPP) 圖像分析軟件測量正中矢狀線區(qū)域骨吸收溶解面積和骨外膜炎性反應細胞數(shù)。

    1.5 TRAP染色檢測破骨細胞增殖分化 按照試劑盒要求對切片進行染色,染色后破骨樣細胞呈特異性棕紅色。Olympus光學顯微鏡 10×、20×和40×條件下觀察, 20×條件下攝像計算正中矢狀線區(qū)域的TRAP+細胞數(shù)量,每張片子中隨機選取 5個高倍視野,求平均數(shù)。

    1.6 骨片掃描電鏡檢查 取材后按電鏡掃描要求準備,在日立S-3000N 掃描電鏡下觀察小鼠顱骨表面的骨質(zhì)吸收情況,采用 IPP 圖像分析軟件計算各組吸收陷窩面積,統(tǒng)計各組 3個標本,每個標本在200倍視野下取5個不同視野進行陷窩面積計算, 取平均值, 計算其占視野面積的百分數(shù)。

    2 結 果

    2.1 HE染色檢測各組骨溶解面積和骨膜炎性反應細胞 空白對照組和純鹽組小鼠骨表面溶解面積和骨膜炎性反應細胞無明顯增加,純鹽組骨膜炎性反應細胞略增高(圖1A和B,見插頁四)。鹽包埋磨損顆粒組和氣囊植骨組小鼠骨溶解面積和骨膜炎性反應細胞明顯增多(圖1 C和D,見插頁四)。IPP圖像分析軟件統(tǒng)計結果顯示:與氣囊植骨組、空白對照組和純鹽組比較,鹽包埋磨損顆粒組骨膜反應細胞數(shù)和小鼠顱骨破壞溶解面積均明顯增加(Plt;0.01)。見表1。

    2.2 TRAP 染色檢測各組TRAP陽性細胞數(shù) 空白對照組和純鹽組小鼠陽性染色區(qū)域不明顯,紅染色面積小,計數(shù)細胞數(shù)量少;鹽包埋磨損顆粒組和氣囊植骨組小鼠陽性染色面積區(qū)域大,細胞數(shù)量明顯增多;鹽包埋磨損顆粒組TRAP陽性細胞數(shù)與其他3組比較明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.01)。TRAP 染色陽性細胞統(tǒng)計結果見表2和圖2(插頁四)。

    表1 各組小鼠骨膜炎性反應細胞數(shù)與骨表面溶解面積

    Tab.1 Number of inflammatory cells and bone surface dissolved area of mice in various groups

    GroupnNumberofinflammatorycellsDissolvedbonearea(A/mm2)Blankcontrol101540±368?0.069±0.024?Puresalt101610±535?0.073±0.012?Airbagbonegraft203163±147?0.225±0.021?Wearparticle103478±376 0.301±0.014

    *Plt;0.01 compared with wear particle group.

    表2 TRAP 染色陽性細胞計數(shù)

    Tab.2 TRAP staining positive cell count

    GroupnNumberofosteoclastsBlankcontrol103.8427±1.1821?Puresalt104.0261±1.3720?Airbagbonegraft2012.5490±1.3724?Wearparticle1017.3250±4.2107

    *Plt;0.01 compared with wear particle group.

    2.3 電鏡下各組小鼠骨吸收區(qū)域形態(tài)表現(xiàn)和視野面積的百分比 空白對照組和純鹽組:骨纖維組織結構緊密,鈣丟失較少,未見明顯吸收陷窩(圖3A和B)。氣囊植骨組和鹽包埋磨損顆粒組: 陷窩形態(tài)多樣,以圓形、橢圓形多見,同時可見臘腸型復合不規(guī)則性,骨吸收區(qū)凹陷形成巖溶現(xiàn)象;陷窩深淺不一,有些深的陷窩邊界清晰、底面粗糙,在陷窩中央可見片絮狀物黏附,周圍及底部可見纖維紋路;有些陷窩較淺,僅有斑點狀骨質(zhì)吸收區(qū)域,骨片表面粗糙、鈣丟失明顯,骨質(zhì)疏松嚴重;鹽包埋磨損顆粒組陷窩大小及深度、鈣丟失和骨質(zhì)疏松程度明顯強于氣囊植骨組。IPP圖像軟件分析骨吸收區(qū)域與視野面積的百分比:空白對照組為(3.09±0.62)%,純鹽組為(3.25±0.78)%,氣囊植骨組為(10.27±3.17)%,鹽包埋磨損顆粒組為(14.58±2.68)%。鹽包埋磨損顆粒組骨吸收區(qū)域與視野面積的百分比高于氣囊植骨組、空白組和純鹽組(Plt;0.01)。

    3 討 論

    本實驗通過構建體內(nèi)急性骨溶解無菌松動病理模型[4],觀察到鹽溶法構建小鼠顱骨溶解模型在HE染色、電鏡掃描、TRAP染色以及骨膜炎性細胞滲出、骨破壞面積及破骨細胞數(shù)目變化明顯優(yōu)于小鼠背部皮下氣囊植骨模型。目前國內(nèi)外學者多采用小鼠背部皮下氣囊植骨建立的假體無菌松動急性骨溶解病理模型[5-6]。該動物模型在建模時,一方面需要使用大量價格昂貴的磨損顆粒,投入資金較多;另一方面由于該建模無血供和神經(jīng)營養(yǎng)支持、無骨組織的參與[7],不能真實模擬磨損顆粒在體內(nèi)誘導溶骨的真實環(huán)境,亦不能真實反映骨組織在重建中成骨細胞的修復和破骨細胞的溶骨的動態(tài)平衡[8]。同樣,對于溶骨現(xiàn)象,這種制模也無法考慮骨自身的修復作用,不能準確做出溶骨定量測定。鹽溶法在磨損顆粒(直徑為2~3 μm )[9]符合誘導溶骨條件的基礎上,把鹽磨損顆?;旌辖Y晶體放置在去部分顱骨外膜處。通過鹽晶體溶解時的理化特性和顱骨黏附較為緊密,在鹽溶解過程中逐漸把適量的磨損顆粒釋放出來,較為均勻的分布在顱骨外,達到直接放置磨損顆粒的目的;另外,由于鹽溶解周圍的高滲狀態(tài)不利于細菌的生長,便于傷口修復,刺激周圍顱骨外膜迅速長入,把磨損顆粒完全包埋在骨膜下,不會出現(xiàn)磨損顆粒向周圍蔓延。該法一方面繼承皮膚縫合包埋法[10]和磨損顆粒懸浮液顱骨外膜膜下注射法[11-12]傳統(tǒng)優(yōu)點,即磨損顆粒直接和骨面接觸,符合模擬假體松動體內(nèi)骨溶解環(huán)境[13];另一方面也克服傳統(tǒng)建模時需要磨損顆粒多、投入資金量大、制模效果不佳、取材不易和實驗動物易死亡等缺點。目前國內(nèi)外學者已經(jīng)很少使用這2種方法。鹽溶法與上述模型一樣,同樣沒有置入真正人工假體,仍然屬于急性溶骨病理模型范疇。因此在研究假體松動的過程中并沒有考慮機械應力對松動的影響,這與人工關節(jié)松動發(fā)生的慢性溶骨過程是有差別的[14]??傊?,該實驗模型的設計克服了上述各種建模的不足,更加簡潔方便、易操作,過程嚴謹可靠, 結果合理有效, 可信度高,是值得推廣的一種基礎實驗方法 。

    圖3 掃描電鏡觀察各組骨吸收情況

    [1] Keener JD,Callaghan JJ,Goetz DD,et al.Twenty - five -year results after chambly total hip arthroplasty in patients less than fifty years old: a concise follow-up of a previous report [J].Bone Joint Surge Am,2003,85(6):1066-1072.

    [2] Harris WH.Wear and perprosthetic osteolysis: the problem[J].Cline Orthop Relate Res,2001,39(3):66-70.

    [3] Ren W,Yang SY,Wooley PH.A novel marine model of orthopedic wear debris associated osteolysis[J].Scand J Rheumatol,2004,33(5):349-357.

    [4] 閆韻飛,王 瑞,趙建寧.人工關節(jié)無菌性松動動物模型的研究進展[J].醫(yī)學研究生學報,2012,4(25):410-413.

    [5] 賈慶衛(wèi),戴尅戎,湯亭亭,等. 改良大鼠氣囊模型在人工關節(jié)假動松動研究中的應用[J].中國矯形外科雜志,2008,16(2):127-130.

    [6] Ren W,Wu B,Peng X,et al.Erythromycin inhibits wear debris induced inflammatory osteolysis in a mourner mode [J].J Or hop Re,2006,24(2):280-290.

    [7] Blair HC,Robinson LJ,Zaidi M,et al.Osteoclast signaling path ways [J].Biochem Biophys Res Commun,2005,3(28):728-738.

    [8] Woolley PH,Morren R,Andary J,et al. Inflammatory responses to or-thopaedic biomaterials in the marine air pouch[J]. Biomaterials,2002,23(2): 517-526.

    [9] 張 亮,陳志榮,吳興臨,等.一種磨損顆粒誘導的骨溶解模型的制作[J].寧夏醫(yī)學雜志,2008,30(4):138-140.

    [10]von Knocha M, Wedemeyer C . The decrease of particle-induced osteolysis after a single dose of bisphosphonate[J].Biomaterials,2005,26(8):1803-1808.

    [11]金 忠,戴 閩,凌義龍,等.破骨細胞在 UHMWPE磨損顆粒誘導的骨溶解中作用機制的實驗研究實用[J].臨床醫(yī)學,2008,9(11):245-246.

    [12]Zhang C,Tang T,Ren W,et al.Influence of mouse genetic background on wears particle-inducedinvivoinflammatory osteolysis[J].Iflamm Res,2008,57(5):211-215.

    [13]Tatro JM,Taki N,Islam AS,et al.The balance between end toxin accumulation and clearance during particle-induced osteolysis in marine calvarias[J].Orthop Res,2007,25(3):361-369.

    [14]丁 悅,黃健斌,秦礎強.人工關節(jié)無菌性松動動物模型的建立[J] 實用骨科雜志,2010,16(7):234-236 .

    Establishmentandevaluationofmouseskulldissolvementmodelinducedbywearparticleswithsaltsolutionmethod

    LIU Ming1,WEI Xiao-lan1,CHEN Ting-mei2,JIANG Rong3,ZHANG Jian4

    (1.Affiliated Hospital,Ankang Vocational Technical College,Ankang 725000,China;2.Key Laboratory of Clinical Laboratory and Diagnostics,Ministry of Education,Department of Laboratory,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;3.Department of Immunohistochemistry,Stem Cells and Tissue Engineering Laboratory,Chongqing Medical University,Changqing 400016,China; 4.Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

    ObjectiveTo build a new type of wear particle induced bone dissolution model,and to provide a simple and convenient aseptic loosening experimental animal model for the study of artificial joints.MethodsA total of 50 BALB/c mice were randomly divided into blank control group,pure salt group(n=10),airbag bone graft group(n=10),and salt embedding wear particle group(n=10).The skull bone samples of mice in airbag bone graft group and other groups were obtained 21 and 14 d after operation,respectively.The number of inflammatory cells and osteolysis area were observed by HE staining.The percentage of bone absorption lacuna area was detected by scanning electron microscope.The proliferation and differentiation of osteoclasts were observed by TRAP stainingResultsThe HE staining results showed that compared with airbag bone graft group and black group, the efflux of inflammatory cells and osteolysis areas in pure salt group and wear particle group were increased significantly (Plt;0.01). The TRAP staining results showed that the number of osteoclasts in airbag bone graft group was significantly lower than that in wear particle group (Plt;0.01).The scanning electron microscope results showed that the percentage of bone absorption lacuna area in wear particle group was significantly higher than that in airbag bone graft group (Plt;0.01).ConclusionSalt solution method is a simple,economic,and fast method to build myuse skull dissolvement models,and it can accurately simulate the pathological process of aseptic loosening after artificial joint replacement.

    wear particle; skull dissolution; aseptic loosening;air pouch model;mice,inbred BALBc

    1671-587Ⅹ(2013)05-1041-04

    10.7694/jldxyxb20130537

    2013-03-28

    重慶市科委研究專題資助課題(CSTC,2010AB5094);重慶市科技攻關計劃項目資助課題(CSTC2010AB5094)

    劉 銘(1976-),男, 陜西省安康市人,主治醫(yī)師,在讀醫(yī)學碩士,主要從事人工關節(jié)感染與松動研究。

    張 健(Tel:023-89011202,E-mail:68733235@sohu.com)

    R-332

    A

    猜你喜歡
    顱骨植骨氣囊
    When weird weather strikes 當怪天氣來臨時
    顱骨血管瘤樣纖維組織細胞瘤1例
    高田氣囊案
    中國汽車界(2016年1期)2016-07-18 11:13:33
    多孔鉭棒聯(lián)合植骨治療成年股骨頭壞死的臨床研究
    More gum disease today than 2,000 years ago
    探討外傷性顱骨缺損行顱骨修補術14例的護理體會
    一期復合植骨外固定架固定、VSD引流治療Gustilo-Anderson Ⅲ型骨折的臨床觀察(附8例報告)
    Observation on Activities of Air Sac in Opened Body Cavity of Chicken
    氣囊助浮大型導管架下水可行性研究
    中藥結合植骨內(nèi)固定治療脛骨骨不連23例
    啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久久久伊人网av| 97超碰精品成人国产| 麻豆乱淫一区二区| 久久影院123| 日韩大片免费观看网站| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久久伊人网av| 欧美三级亚洲精品| 国产精品伦人一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 久久99热这里只频精品6学生| 久久影院123| 色吧在线观看| 美女主播在线视频| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 内射极品少妇av片p| av专区在线播放| 性色av一级| 亚洲精品日本国产第一区| 日日爽夜夜爽网站| 偷拍熟女少妇极品色| 美女国产视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 曰老女人黄片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 精品久久国产蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日本午夜av视频| 亚洲高清免费不卡视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产有黄有色有爽视频| 亚洲久久久国产精品| h视频一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 99热全是精品| 丝袜脚勾引网站| 毛片一级片免费看久久久久| 黄色怎么调成土黄色| 久久久精品94久久精品| 在线观看三级黄色| 久久久久久伊人网av| 日本午夜av视频| 街头女战士在线观看网站| 久久女婷五月综合色啪小说| a级片在线免费高清观看视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 男女无遮挡免费网站观看| 高清在线视频一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品国产av成人精品| av国产精品久久久久影院| 一本色道久久久久久精品综合| 国内揄拍国产精品人妻在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 嘟嘟电影网在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 婷婷色av中文字幕| 国产爽快片一区二区三区| 乱人伦中国视频| 精品亚洲成国产av| av在线app专区| 国产日韩欧美在线精品| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久婷婷青草| 蜜桃在线观看..| 色5月婷婷丁香| 国产在线视频一区二区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲国产日韩一区二区| .国产精品久久| 老司机影院毛片| 色网站视频免费| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美精品一区二区免费开放| 最新的欧美精品一区二区| av福利片在线| 精品国产一区二区久久| 亚洲av福利一区| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲成人手机| 2021少妇久久久久久久久久久| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品蜜桃在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | av免费在线看不卡| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 一级毛片久久久久久久久女| 日本av手机在线免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜91福利影院| 51国产日韩欧美| 人妻系列 视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产淫语在线视频| 两个人免费观看高清视频 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲国产欧美在线一区| 嫩草影院新地址| 精品久久久精品久久久| 最近的中文字幕免费完整| 伊人久久国产一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 综合色丁香网| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲精品456在线播放app| 国产69精品久久久久777片| 免费黄频网站在线观看国产| 久久狼人影院| 在线精品无人区一区二区三| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 草草在线视频免费看| 偷拍熟女少妇极品色| 久久国内精品自在自线图片| 成人二区视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品一区二区三区视频在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久久国产欧美日韩av| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品久久久久久久久av| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲,欧美,日韩| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲av中文av极速乱| 国产伦精品一区二区三区视频9| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看免费高清a一片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 伊人久久国产一区二区| 中文资源天堂在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品成人在线| 亚洲精品色激情综合| 青青草视频在线视频观看| 国产片特级美女逼逼视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 另类亚洲欧美激情| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久99精品国语久久久| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久久精品性色| 国产精品久久久久久久久免| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 秋霞伦理黄片| 波野结衣二区三区在线| av在线观看视频网站免费| 国产男女内射视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 伦精品一区二区三区| 22中文网久久字幕| 99久久精品热视频| 9色porny在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 观看免费一级毛片| 久久综合国产亚洲精品| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜免费观看性视频| 久久国产精品大桥未久av | 下体分泌物呈黄色| 欧美 日韩 精品 国产| a级一级毛片免费在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 少妇人妻 视频| 免费大片18禁| 99热全是精品| 日韩一区二区视频免费看| av福利片在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚州av有码| 精品少妇久久久久久888优播| 精品一区二区三区视频在线| 乱人伦中国视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产极品天堂在线| 高清av免费在线| 一区二区三区免费毛片| 极品教师在线视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 国产在线视频一区二区| 国产黄频视频在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品酒店卫生间| 一区在线观看完整版| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久久久久久久成人| 永久网站在线| 精品国产一区二区久久| 免费观看性生交大片5| 水蜜桃什么品种好| 一个人免费看片子| av福利片在线观看| 国产一区二区在线观看av| 天美传媒精品一区二区| 欧美丝袜亚洲另类| 午夜免费男女啪啪视频观看| 永久免费av网站大全| 2018国产大陆天天弄谢| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲美女搞黄在线观看| 大香蕉久久网| 日韩伦理黄色片| 国产黄片视频在线免费观看| 少妇熟女欧美另类| 久久久精品免费免费高清| 少妇高潮的动态图| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 岛国毛片在线播放| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 成年人午夜在线观看视频| 日韩电影二区| 麻豆成人av视频| 久久99精品国语久久久| 在线观看国产h片| 欧美丝袜亚洲另类| 国产探花极品一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 视频区图区小说| av一本久久久久| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久久久网色| 少妇精品久久久久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲av福利一区| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产av一区二区精品久久| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 两个人免费观看高清视频 | av黄色大香蕉| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 免费观看性生交大片5| av黄色大香蕉| 国产精品国产三级专区第一集| 精品一区二区免费观看| 综合色丁香网| 高清毛片免费看| 亚洲欧美精品自产自拍| 人人澡人人妻人| 天堂俺去俺来也www色官网| 六月丁香七月| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩一区二区视频免费看| 99热国产这里只有精品6| 水蜜桃什么品种好| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 十分钟在线观看高清视频www | 精品亚洲成a人片在线观看| 22中文网久久字幕| 大片免费播放器 马上看| 日韩亚洲欧美综合| 麻豆成人av视频| 午夜av观看不卡| 中国国产av一级| 精品人妻熟女av久视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 欧美一级a爱片免费观看看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 一本一本综合久久| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲综合色惰| 欧美日韩av久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久午夜福利片| 99热这里只有是精品50| 永久免费av网站大全| 国产亚洲最大av| 久久久久网色| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一区二区三区精品91| 观看美女的网站| 青春草国产在线视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久久久久大av| 人人澡人人妻人| 亚洲不卡免费看| 精品熟女少妇av免费看| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品嫩草影院av在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 日日啪夜夜撸| 观看美女的网站| 亚洲人成网站在线播| 久久国产精品大桥未久av | 国产精品99久久99久久久不卡 | 好男人视频免费观看在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 伦理电影免费视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| av播播在线观看一区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产av码专区亚洲av| 久久6这里有精品| 日本欧美视频一区| 午夜日本视频在线| 日韩强制内射视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 婷婷色综合大香蕉| 精品少妇久久久久久888优播| 伊人久久国产一区二区| 欧美区成人在线视频| 有码 亚洲区| 国产精品一区www在线观看| 国产毛片在线视频| 26uuu在线亚洲综合色| 丰满少妇做爰视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产黄色免费在线视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久精品国产a三级三级三级| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费大片18禁| 精品人妻一区二区三区麻豆| 最近中文字幕2019免费版| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产真实伦视频高清在线观看| 18禁在线播放成人免费| 国产色爽女视频免费观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 丰满乱子伦码专区| 久热久热在线精品观看| www.av在线官网国产| 国产精品人妻久久久影院| 超碰97精品在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲av不卡在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲熟女精品中文字幕| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 乱人伦中国视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 成人美女网站在线观看视频| 久久久国产一区二区| 夜夜爽夜夜爽视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 美女中出高潮动态图| 亚洲内射少妇av| 日韩视频在线欧美| 男女国产视频网站| 99re6热这里在线精品视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久婷婷青草| 亚洲精品乱久久久久久| 特大巨黑吊av在线直播| a级毛片在线看网站| 嫩草影院入口| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲自偷自拍三级| 国产91av在线免费观看| 男人舔奶头视频| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美+日韩+精品| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 毛片一级片免费看久久久久| 麻豆成人av视频| 免费观看性生交大片5| 欧美日本中文国产一区发布| 久久6这里有精品| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av一本久久久久| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看 | kizo精华| 一区二区三区四区激情视频| 九九在线视频观看精品| 日韩亚洲欧美综合| 这个男人来自地球电影免费观看 | 午夜福利,免费看| 久久青草综合色| 大香蕉久久网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 午夜91福利影院| 制服丝袜香蕉在线| 一级黄片播放器| 国产 一区精品| 成年av动漫网址| 亚洲国产av新网站| 99热这里只有是精品50| 伦理电影免费视频| 黄色配什么色好看| 日韩欧美精品免费久久| 久久久久久久久久久久大奶| 成人二区视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费黄频网站在线观看国产| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品一二三| 国产黄片视频在线免费观看| 国产av精品麻豆| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲av国产av综合av卡| 丝袜在线中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国产真实伦视频高清在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日韩精品有码人妻一区| 如何舔出高潮| 边亲边吃奶的免费视频| 一级毛片我不卡| 亚洲久久久国产精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 少妇精品久久久久久久| 亚洲国产av新网站| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 五月天丁香电影| 午夜精品国产一区二区电影| 久久免费观看电影| av国产久精品久网站免费入址| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品一区在线观看国产| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日日啪夜夜爽| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 九草在线视频观看| 青青草视频在线视频观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 成人黄色视频免费在线看| 日日啪夜夜爽| 丰满乱子伦码专区| av有码第一页| 老司机影院成人| 这个男人来自地球电影免费观看 | 岛国毛片在线播放| 国产精品熟女久久久久浪| 男女边摸边吃奶| 国产精品伦人一区二区| 美女国产视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 色视频在线一区二区三区| av天堂中文字幕网| 欧美xxxx性猛交bbbb| 美女主播在线视频| 国产日韩欧美在线精品| 一级毛片久久久久久久久女| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| av播播在线观看一区| 国产乱人偷精品视频| 国产精品欧美亚洲77777| 久久鲁丝午夜福利片| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品国产三级专区第一集| 自线自在国产av| 一边亲一边摸免费视频| 久久久久国产网址| 成年人午夜在线观看视频| 日本av免费视频播放| 91成人精品电影| 国产高清国产精品国产三级| 久久国产精品大桥未久av | 深夜a级毛片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产亚洲最大av| h日本视频在线播放| 亚洲国产色片| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩电影二区| 高清不卡的av网站| 欧美精品一区二区大全| 午夜精品国产一区二区电影| 九色成人免费人妻av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 99久久精品国产国产毛片| 在线观看免费日韩欧美大片 | 熟女电影av网| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久久伊人网av| 蜜桃在线观看..| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 大话2 男鬼变身卡| 如何舔出高潮| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 男男h啪啪无遮挡| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 99热这里只有是精品在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 最后的刺客免费高清国语| 国产极品天堂在线| 丁香六月天网| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 中文字幕人妻丝袜制服| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲精品自拍成人| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人精品久久久久久| 最近中文字幕2019免费版| 下体分泌物呈黄色| 亚洲欧洲国产日韩| av专区在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 青春草亚洲视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 欧美丝袜亚洲另类| 国产男人的电影天堂91| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产精品久久久久久av不卡| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 内地一区二区视频在线| 国产男人的电影天堂91| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲天堂av无毛| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久 成人 亚洲| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 麻豆成人av视频| 在现免费观看毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产黄片美女视频| 免费在线观看成人毛片| 黑人高潮一二区| 亚洲性久久影院| 国产亚洲精品久久久com| 婷婷色综合大香蕉| av视频免费观看在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 欧美日韩在线观看h| 男女无遮挡免费网站观看| 毛片一级片免费看久久久久| 久久久午夜欧美精品| 精品亚洲成国产av| 久久99热这里只频精品6学生| 大话2 男鬼变身卡| 18禁动态无遮挡网站| 丰满乱子伦码专区| 久久国产精品大桥未久av | 少妇人妻 视频| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜免费男女啪啪视频观看| 丰满少妇做爰视频| 成人黄色视频免费在线看| 久久这里有精品视频免费| 精品久久久精品久久久| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美变态另类bdsm刘玥| 高清欧美精品videossex| 久久精品国产自在天天线| kizo精华| 日韩亚洲欧美综合| 99久久精品热视频| 国产精品99久久久久久久久| 女性被躁到高潮视频| 99久久精品热视频| 亚洲久久久国产精品| 曰老女人黄片| 女人精品久久久久毛片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看|