4種魚(yú)肉羥脯氨酸含量的測(cè)定

張延華，馬國(guó)紅，王愛(ài)英，王秉利，許 鵬 （山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東濟(jì)南250117）

膠原蛋白又稱膠原，是動(dòng)物體內(nèi)結(jié)締組織的重要組成成分，約占其體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的1／4［1］。膠原蛋白含有豐富的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸。羥脯氨酸 （Hydroxyproline，Hyp）是膠原蛋白的特征性氨基酸，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量，然后乘以相應(yīng)的系數(shù)就可以得到膠原蛋白的含量。羥脯氨酸的測(cè)定包括比色法、氨基酸分析儀法和HPLC法、電泳法等，以比色法最為常用［2］。

提取膠原蛋白的傳統(tǒng)原料主要是陸生哺乳動(dòng)物，如豬、牛的皮和骨。由于近年來(lái)哺乳動(dòng)物疫病的爆發(fā)和人畜共患病的增加，世界各國(guó)都在積極尋找新的膠原蛋白來(lái)源，同時(shí)漁業(yè)養(yǎng)殖的大規(guī)模發(fā)展使水產(chǎn)膠原蛋白替代哺乳動(dòng)物成為可能。不少學(xué)者對(duì)魚(yú)類組織中的羥脯氨酸進(jìn)行測(cè)定，以為尋找新的膠原蛋白原料提供理論依據(jù)。張俊杰等［3］曾用比色法測(cè)定魚(yú)鱗中羥脯氨酸，胡建平［4］對(duì)魚(yú)骨中的羥脯氨酸進(jìn)行過(guò)測(cè)定，魚(yú)皮中的羥脯氨酸含量也有過(guò)報(bào)道，但魚(yú)肉中羥脯氨酸的含量卻鮮有報(bào)道。本研究選取草魚(yú)（Ctencpharyngodon idellus）、鯉魚(yú) （Cyprinus carpio）、鳙魚(yú) （Aristichthys mobilis）、羅非魚(yú) （Oreochromis mossambicus）作為研究對(duì)象，對(duì)其魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量用比色法進(jìn)行測(cè)定，以期為魚(yú)肉的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)均購(gòu)自濟(jì)南市某水產(chǎn)品市場(chǎng)，魚(yú)體健康無(wú)病，體重1kg左右，冰塊保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，每尾魚(yú)分別取背部的肌肉。由于受生長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)條件、魚(yú)體大小等因素的影響，魚(yú)體不同部位肌肉所測(cè)得的結(jié)果會(huì)有差異。就同種魚(yú)類來(lái)說(shuō)，魚(yú)體背部肌肉的營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)比較穩(wěn)定。為了便于取樣與比較，本研究中的采樣統(tǒng)一取背部肌肉即自魚(yú)體兩側(cè)鰓蓋骨后至尾鰭前取體背部肌肉作為樣品進(jìn)行測(cè)定。用刀將魚(yú)肉在冷凍時(shí) （0℃以下）切成小塊 （約0.5cm3，邊長(zhǎng)約為8mm），置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。其中一部分用于常?guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定，一部分用于羥脯氨酸的測(cè)定。

1.2 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分含量測(cè)定采用105℃烘干失水法［5］，粗蛋白含量測(cè)定采用微量凱式定氮儀法［6］，粗脂肪含量測(cè)定采用索氏抽提法［7］，灰分含量測(cè)定采用550℃干法灰化法［8］。

1.3 羥脯氨酸含量的測(cè)定

4種魚(yú)肌肉樣品的羥脯氨酸含量測(cè)定方法參照GB／T 9695.23－2008／ISO 3496：1994［9］略作修改。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按文獻(xiàn) ［9］的方法分別制得濃度依次為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg／ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。再分別移取4.00ml羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液于比色管中，加入2.00ml氯胺試劑，混合后于室溫下放置 （20±1）min。加入2.00ml顯色劑于比色管中，充分混合，用塑料薄膜將比色管封口，迅速放入60℃水浴中，保溫20min。取出比色管，用流動(dòng)水冷卻比色管至少3min，在室溫下放置30min。用水作參比，于（558±2）nm處用分光光度計(jì)測(cè)定光密度值。以扣除了空白的標(biāo)準(zhǔn)工作液的光密度為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 測(cè)定步驟

將切好的試樣裝入耐熱塑料袋中，70℃以上保溫30min后，冷卻。用絞肉機(jī)將試樣均質(zhì)。稱取4g試樣 （精確至0.001g）于燒瓶中，避免試樣粘在燒瓶壁上。量取 （30±1）ml硫酸溶液，加入燒瓶中，用表面皿蓋住，于105℃干燥箱內(nèi)恒溫16h。用圓形濾紙趁熱將水解產(chǎn)物過(guò)濾至250ml容量瓶中。用10ml硫酸溶液分3次洗滌燒瓶和濾紙，合并至上述容量瓶中。用水定容，搖勻。

用移液管移取一定體積 （V）的水解產(chǎn)物至250ml容量瓶中，定容后羥脯氨酸的濃度在0.5～2μg／ml之間。移取4.00ml上述溶液于比色管中，加入2.00ml氯胺試劑，混合后于室溫下放置（20±1）min。按1.3.1所述步驟與方法，用水作參比，于 （558±2）nm處用分光光度計(jì)測(cè)定光密度值。

1.3.3 羥脯氨酸含量計(jì)算

扣除空白溶液的吸收，從所得標(biāo)準(zhǔn)曲線查得水解產(chǎn)物中羥脯氨酸的含量。試樣中羥脯氨酸的含量按下式計(jì)算：

式中：X為試樣中羥脯氨酸的含量，%；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中羥脯氨酸的濃度，μg／ml；m為試樣質(zhì)量，g；V為從250ml容量瓶中吸取濾液的體積，ml。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量

4種魚(yú)肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，4種魚(yú)肌肉中都含有大量的水分，其中鳙魚(yú)、羅非魚(yú)都在80g／100g以上；草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)4種魚(yú)肌肉中干物質(zhì) 分 別 占 21.23%、25.68%、18.58% 和19.13%，這些干物質(zhì)中大部分為蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)含量分別占4種魚(yú)肌肉干物質(zhì)總量的76.22%、66.48%、83.66%和85.43%，其大小順序?yàn)榱_非魚(yú)＞鳙魚(yú)＞草魚(yú)＞鯉魚(yú)。因此，僅從蛋白質(zhì)含量來(lái)說(shuō)，魚(yú)肉是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)來(lái)源。4種魚(yú)肉中鯉魚(yú)的脂肪含量最高，草魚(yú)次之，鳙魚(yú)、羅非魚(yú)最低。4種魚(yú)灰分含量相差不大。

表1 4種魚(yú)肌肉基本營(yíng)養(yǎng)成分（鮮樣） g／100g

2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以羥脯氨酸濃度 （μg／ml）為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 （圖1），計(jì)算得其回歸方程為：y＝0.1692x＋0.0018，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9856，可見(jiàn)，光密度和羥脯氨酸濃度之間有很好的相關(guān)性。

2.3 肉樣羥脯氨酸含量

4種魚(yú)肌肉樣品的羥脯氨酸含量測(cè)定與計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 4種魚(yú)肉中羥脯氨酸含量

由表2可知，草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)魚(yú)肉中羥脯氨酸平均含量分別為0.0781、0.0743、0.0725、0.0724g／100g。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，草魚(yú)、鯉魚(yú)、鳙魚(yú)、羅非魚(yú)的魚(yú)肉中羥脯氨酸分別為0.0781、0.0743、0.0725、0.0724g／100g，含量相差不大。這與文獻(xiàn)報(bào)道的魚(yú)皮中羥脯氨酸含量羅非魚(yú)皮 （1.86%）、金槍魚(yú)皮（2.04%）［10］相比，淡水魚(yú)肉中的羥脯氨酸含量均較低。

［1］張其清，王彭延，朱明華，等.膠原材料的生物學(xué)評(píng)價(jià) ［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，1989，6（3）：216－218.

［2］張自強(qiáng)，趙東旭，楊新林.羥脯氨酸的研究與開(kāi)發(fā) ［J］.氨基酸和生物資源，2006，28（1）：55－58.

［3］張俊杰，曾慶孝.魚(yú)鱗中羥脯氨酸的測(cè)定 ［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），2004，13（1）：53－55.

［4］胡建平.魚(yú)骨膠原蛋白的黏度特性研究 ［J］.食品與發(fā)酵科技，2006，45（6）：36－44.

［5］GB 5009.3－2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定 ［S］.

［6］GB／T 6432－94飼料中粗蛋白測(cè)定方法 ［S］.

［7］GB／T 6438－92飼料粗灰分的測(cè)定 ［S］.

［8］GB／T 5009.6－2003食品中脂肪的測(cè)定 ［S］.

［9］GB／T 9695.23－2008／ISO 3496：1994肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定 ［S］.

［10］楊樹(shù)奇，曾少葵，周春霞，等.3種魚(yú)皮的基本成分及氨基酸組成分析 ［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（1）：97－100.