HIF－1α基因轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞中的作用

劉 城，吳平生，王月剛，裴靜嫻，賴艷嫻

廣州市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣東廣州510180)

缺血性血管疾病已成為威脅人類健康的重大疾病。雖然目前在保守治療(常規(guī)藥物治療)和血運(yùn)重建(經(jīng)皮介入及外科手術(shù))均取得了重大進(jìn)展，然而，相當(dāng)一部分患者目前的藥物治療難以見(jiàn)效，也不適于常規(guī)血運(yùn)重建術(shù)處理，且相關(guān)治療費(fèi)用高昂。為解決這一問(wèn)題，開辟了新的治療途徑——治療性血管新生。低氧誘導(dǎo)因子－1(hypoxia inducible factor 1，HIF－1)是細(xì)胞對(duì)低氧/缺氧作出適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是治療性血管新生領(lǐng)域中最具有前途的治療基因之一。HIF－1由α亞單位和β亞單位構(gòu)成，HIF－1α是功能性亞基，其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性主要受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)［1］。HIF－1α結(jié)構(gòu)域中含有氧依賴降解區(qū)(Oxygen Dependent Degradation Domain，ODDD)，ODDD 區(qū)Pro402以及Pro5642個(gè)脯氨酸殘基是否羥基化決定其蛋白穩(wěn)定性［2］。常氧情況下，Pro402和/或 Pro564被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase domain，PHD)羥化后，經(jīng)泛素途徑降解，故HIF－1α在常氧下的半衰期很短，約1～2 min，5 min即可全部降解［3］。低氧時(shí)，該過(guò)程受到抑制，HIF－1α不被降解因而變得穩(wěn)定。另一方面，氧濃度除了對(duì)HIF－1α蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)以外，更為重要的是對(duì) HIF－1α 轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)［4］。HIF－1α的 C末端含有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(CTransactivation Domains，C－TAD)。常氧情況下，CTAD結(jié)構(gòu)域內(nèi)803位點(diǎn)上的天門冬酰胺(Asn803)被羥化，其轉(zhuǎn)錄活性下降。故即使蛋白穩(wěn)定的HIF轉(zhuǎn)位到核內(nèi)后，因HIF－1α 的 C－TAD Asn803羥化，激活下游靶基因的能力下降;低氧時(shí)，該過(guò)程受到抑制，不能有效的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)Asn803羥基反應(yīng)，從而導(dǎo)致HIF－1α的高轉(zhuǎn)錄活性，故Asn803為HIF－1α轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)［5］。更關(guān)鍵的是，C－TAD區(qū)不僅決定其轉(zhuǎn)錄活性，而且決定其是否能與輔助激活因子結(jié)合，這是啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵［6］。因此，我們將HIF－1α 的 564、402、803三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)或聯(lián)合位點(diǎn)突變，以重點(diǎn)觀察HIF－1α基因轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)(Asn803)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 第5代hMSCs(本課題組培養(yǎng))，本課題組成功構(gòu)建的野生型HIF－1α重組腺病毒載體(Ad－HIF－1αnative)，Pro564單突變型 HIF－1α 重組腺病毒載體(Ad－HIF－1α564)，Pro564Pro402雙突變型HIF－1α 重組腺病毒載體(Ad－HIF－1α564/402)以及Pro564Asn803雙突變型HIF－1α重組腺病毒載體(Ad－HIF－1α564/803)。鼠抗人 Tubulin單克隆抗體(Santa Cruz)，鼠抗人 HIF－1α、Nkx2.5 單克隆抗體(Chemicon)，兔抗人VEGF多克隆抗體(武漢博士德)，心肌肌鈣蛋白I試劑盒(DadeBehring，Inc)。細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(碧云天生物科技公司)。hMSCs培養(yǎng)基(10%胎牛血清FCS)，1%200mmol/L L－谷氨酰胺溶液(L－Gln的DMEM－LG培養(yǎng)基)，心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(5%FCS，1%200 mmol/L L－Gln的 DMEM－LG培養(yǎng)基)，心肌細(xì)胞誘導(dǎo)液(10%FCS，1%1 mmol/L5－aza DMEM－LG 溶液，1%200mmol/LL－Gln的DMEM－LG培養(yǎng)基)。

1.2 方法

1.2.1 X－gal組織化學(xué)染色法測(cè)定重組腺病毒轉(zhuǎn)染效率及最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)hMSCs以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，8h后換成無(wú)血清、含L－Gln的DMEM－LG培養(yǎng)基，維持 24 h 后，分別以 MOI為 0，20，50，75，100，200OPU/cell轉(zhuǎn)染 Ad－LacZ，hMSCs培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，10%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS液洗滌三次，加入X－gal染色液，37℃ 孵育12～24h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果，以能夠獲得有效轉(zhuǎn)染率同時(shí)又能盡量避免腺病毒本身對(duì)細(xì)胞的毒性的MOI值為最佳MOI。

1.2.2 不同突變型 HIF－1α 基因轉(zhuǎn)染 5－aza誘導(dǎo)中的hMSCs hMSCs以1×105個(gè)細(xì)胞接種到75 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2培養(yǎng);待細(xì)胞貼壁后將hMSCs培養(yǎng)基換成心肌細(xì)胞誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng);24 h后將心肌細(xì)胞誘導(dǎo)液換成心肌細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng);24 h后將各純化重組腺病毒 Ad－LacZ、Ad－HIF－1αnative、Ad－HIF－1α564、Ad－HIF－1α564/402和 Ad－HIF－1α564/803，以最佳MOI轉(zhuǎn)染前述心肌細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后的hMSCs，3h后換成無(wú)病毒的心肌細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng);每3～4d更換心肌細(xì)胞培養(yǎng)基1次，細(xì)胞不予傳代。

1.2.3 cTnI測(cè)定 將 1.2.2 中所述，誘導(dǎo)培養(yǎng)后第 6周，進(jìn)行cTnI免疫組化染色鑒定，并提取細(xì)胞漿蛋白，一步法酶聯(lián)免疫分析測(cè)定cTnI表達(dá)量。

1.2.4 HIF－1α 與 VEGF 蛋白表達(dá)測(cè)定 將 1.2.2中所述，誘導(dǎo)培養(yǎng)后第6周，提取細(xì)胞漿蛋白，行Western blot檢測(cè)。結(jié)果用光密度掃描儀掃描、影像軟件Gel－pro analysis分析，面積×密度代表表達(dá)量。

1.2.5 姜黃素抑制HIF－1α 基因Asn803位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性后VEGF mRNA表達(dá)測(cè)定 將1.2.2中所述，誘導(dǎo)培養(yǎng)后第6周，更換為含有120 μmol/L姜黃素的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用RT－PCR檢測(cè)細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)水平的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用 SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用OneWay－ANOVA方差分析，方差齊性時(shí)組間比較采用LSD法，方差不齊時(shí)組間比較采用Games－Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 重組腺病毒轉(zhuǎn)染hMSCs效率 Ad－LacZ轉(zhuǎn)染hMSCs 48h后X－gal染色結(jié)果顯示:20及50 OPU/cell轉(zhuǎn)染率較低，75 OPU/cell的滴度可獲得較高的轉(zhuǎn)染率，約26%的細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)染。100及200 OPU/cell引起細(xì)胞死亡、脫落，顯示出腺病毒毒性。因此選用75OPU/cell為最佳MOI。

2.2 不同HIF－1α基因在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞中的作用 用 Ad－LacZ，Ad－HIF－1α，Ad－HIF－1α564，Ad－HIF－1α564/402，Ad－HIF－1α564/803轉(zhuǎn)染hMSCs后第6周測(cè)得cTnI值，見(jiàn)表1。

2.3 不同HIF－1α 基因轉(zhuǎn)染5－aza誘導(dǎo)中的hMSCs后HIF－1α、VEGF蛋白的表達(dá) 用 Ad－LacZ，Ad－HIF－1αnative，Ad－HIF－1α564，Ad－HIF－1α564/402，Ad－HIF－1α564/803轉(zhuǎn)染 hMSCs后于第6周測(cè)得的 HIF－1α、VEGF蛋白水平如圖1所示。

表1 不同HIF－1α基因轉(zhuǎn)染5－aza誘導(dǎo)的hMSCs后 cTnI的表達(dá)

圖1 不同HIF－1α基因轉(zhuǎn)染5－aza誘導(dǎo)的hMSCs后 HIF－1α、VEGF 表達(dá)水平

2.4 姜黃素抑制HIF－1α基因Asn803位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄活性后VEGF mRNA表達(dá)測(cè)定 我們使用了CBP/p300活性抑制劑——姜黃素阻斷CBP/p300的功能，以觀察VEGF mRNA表達(dá)水平的變化，如圖2示。

3 討論

圖2 姜黃素對(duì)HIF－1α基因轉(zhuǎn)染5－aza誘導(dǎo)的hMSCs后VEGF表達(dá)水平的影響

缺血性心臟病目前治療主要是常規(guī)的藥物治療、冠脈介入(PCI)及冠脈旁路移植術(shù)(CABG)，然而相當(dāng)一部分患者藥物治療難以見(jiàn)效，也不適于常規(guī)血運(yùn)再通術(shù)處理，所以必須尋求其它新的治療途徑—干細(xì)胞移植成為治療心肌梗死的新策略。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了野生型及各突變型HIF－1α的重組腺病毒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的hMSCs，研究HIF－1α不同突變位點(diǎn)對(duì)誘導(dǎo)環(huán)境下hMSCs向心肌細(xì)胞分化過(guò)程的影響。我們用重組腺病毒介導(dǎo)的不同HIF－1α基因轉(zhuǎn)染5－aza誘導(dǎo)的hMSCs6周后應(yīng)用Westernblot檢測(cè)HIF－1α蛋白表達(dá)水平，野生型及突變型 HIF－1α蛋白均有較高表達(dá)，但以 Pro402Pro564雙突變型HIF－1α組HIF－1α蛋白表達(dá)水平最高。與此同時(shí)，在常氧條件下經(jīng)5－aza誘導(dǎo)后的hMSCs中 cTnI的表達(dá)也相應(yīng)升高，其中以 Pro564Asn803雙突變型HIF－1α組cTnI表達(dá)水平最高。這表明高HIF－1α的表達(dá)可促進(jìn)hMSCs向心肌細(xì)胞分化。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)比Pro402Pro564雙突變型HIF－1α組與Pro564Asn803雙突變型 HIF－1α組 HIF－1α與cTnI表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，雖然Pro402Pro564雙突變型HIF－1α組HIF－1α蛋白表達(dá)水平較Pro564Asn803雙突變型 HIF－1α 組高，但 Pro564Asn803雙突變型 HIF－1α組cTnI的表達(dá)水平反而較前者更為明顯，進(jìn)一步說(shuō)明Asn803位點(diǎn)在HIF－1α促進(jìn)hMSCs向心肌細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用。故我們可以推斷，心肌細(xì)胞在缺氧條件環(huán)境中，hMSCs可以分化成心肌細(xì)胞以提高心肌對(duì)缺氧應(yīng)激的耐受能力，而這種分化被Pro564Asn803雙突變型HIF－1α基因增強(qiáng)。

進(jìn)一步比較 HIF－1α 基因 Pro402、Pro564、Asn803三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)或聯(lián)合位點(diǎn)突變后，各突變型HIF－1α的表達(dá)在促進(jìn)hMSCs向心肌細(xì)胞分化中的效能:(1)通過(guò)對(duì)比野生型HIF－1α基因、Pro564單突變型HIF－1α基因以及Pro564Asn803雙突變型HIF－1α基因三個(gè)實(shí)驗(yàn)組cTnI表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，Pro564單突變型HIF－1α基因組cTnI表達(dá)水平僅比野生型HIF－1α 基因組增加了約 1.7%，而 Pro564Asn803雙突變型HIF－1α基因cTnI表達(dá)水平比Pro564單突變型HIF－1α 基因組增加了約 8.4%，說(shuō)明在 HIF－1α 基因Pro564單一位點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上同時(shí)將Asn803位點(diǎn)突變，新的Pro564Asn803雙突變型HIF－1α基因在促進(jìn)hMSCs向心肌細(xì)胞分化中的效能較Pro564單突變型HIF－1α基因組提升了近5倍。(2)同時(shí)對(duì)比Pro564單突變型HIF－1α基因與Pro564Pro402雙突變型HIF－1α基因兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組cTnI表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，Pro402Pro564雙突變型HIF－1α組cTnI表達(dá)水平僅比Pro564單突變型HIF－1α基因組增加3.0%。故說(shuō)明雖然Pro564Pro402雙突變型HIF－1α基因以及Pro564Asn803雙突變型HIF－1α基因均為組成型表達(dá)型HIF－1α突變基因，但后者優(yōu)于前者，且進(jìn)一步揭示了Asn803位點(diǎn)在HIF－1α促進(jìn)hMSCs向心肌細(xì)胞分化中的關(guān)鍵作用。

HIF－1α作為一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能在低氧條件下有效地促進(jìn)hMSCs向心肌細(xì)胞分化，依賴于其TAD與相應(yīng)的輔助激活因子CREB結(jié)合蛋白/腺病毒E1A相關(guān)蛋白p300(CREB－binding protein/adenovirus E1A－binding protein p300，CBP/p300)相互作用從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄［6－7］。有研究表明，通過(guò)構(gòu)建CBP/p300缺陷型大鼠以阻斷了HIF－1α與 CBP/p300之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)有(35～50)%HIF－1α下游靶基因的表達(dá)需要 CBP/p300［8］。故我們提出 HIF－1α 存在 CBP/p300 依賴性機(jī)制。我們使用了CBP/p300活性抑制劑——姜黃素［9］阻斷CBP/p300的功能，以觀察HIF－α誘導(dǎo)的促血管新生基因表達(dá)水平的變化。我們研究結(jié)果顯示:在使用姜黃素將CBP/p300活性抑制條件下，VEGF mRNA表達(dá)水平較未抑制組平均減少了(50.9±4.6)%。然而，在CBP/p300活性受同等抑制條件下，Pro564Asn803雙突變型 HIF－1α基因組VEGF mRNA表達(dá)水平雖然較未抑制組減少了約40%，但仍顯著高于 Pro564單突變型 HIF－1α基因組，這些結(jié)果說(shuō)明除了CBP/p300外，還有其它輔助激活因子通過(guò)Asn803位點(diǎn)啟動(dòng)HIF－1α下游基因的轉(zhuǎn)錄，這一機(jī)制可能與 HDAC 有關(guān)［8－10］，對(duì)其有如下解釋:(1)HDAC直接與HIF－1α－CBP/p300復(fù)合體相互作用，并共同轉(zhuǎn)入核內(nèi)增強(qiáng)HIF－1α誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄活性［11］;(2)HDAC間接的促進(jìn)P300與HIF－1α 的結(jié)合，并與 CBP/p300 去乙酰化［12］，以及HIF－1α 從 FIH－1上解離出來(lái)有關(guān)［13］。

本研究表明HIF－1α基因轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)Asn803在HIF－1α促進(jìn)hMSCs向心肌細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，其可能通過(guò) HIF－1α－CBP/p300－HDAC 復(fù)合體的形式來(lái)共同參與基因轉(zhuǎn)錄的，為HIF－1α和hM-SCs在缺血性疾病治療中的聯(lián)合應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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