人血清白蛋白基因的克隆及其真核表達載體構(gòu)建

洪志勇 李玉芳，2 張興峰 林秀嬌 李鴻翔 莊益芬 張文昌*

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院 福州 350002；2.黃淮學院 河南駐馬店 463000）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)成分，約占血漿總蛋白的60%。在體內(nèi)人血清白蛋白主要起著維持滲透壓、保證液體在血管中流動、遞送重要生化物質(zhì)以及作為高容量儲庫穩(wěn)定體內(nèi)游離配基的濃度。由于它在輸血、補液、治療發(fā)燒、外傷休克、抗利尿水腫等臨床應用上的顯著療效，HSA 在國內(nèi)外都有很大的市場需求。據(jù)近年報道，目前HSA 全球年銷售量高達600 t左右，按目前50 美元／10g 計，每年銷售額在30 億美元以上。HSA 在全球的需求量呈上升態(tài)勢，近年來我國白蛋白需求量每年以49.2%的速度上升。然而市售HSA 主要從捐血者血漿或人胎盤中提取。但近年來越來越多的人因輸入血制品HSA 而感染了艾滋病、肝炎等傳染性疾病。血源病毒污染，加之國家對血制品嚴格控制進口，致使HSA 供應十分緊張，人們迫切期望開發(fā)新的來源。為緩解這些矛盾，通過基因工程技術(shù)把人血清白蛋白基因克隆到微生物、動物生物反應器上進行高效表達是最具有前景的方法。HSA 基因全長16 916 bp，由14個內(nèi)含子和15個外顯子構(gòu)成，定位于人4 號染色體的q11-22 區(qū)段。目前已在小鼠［1］、乳牛［2］、豬［3］、綿羊等［4-5］系統(tǒng)中表達了重組HSA。

目前，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)重要的人類藥物蛋白的優(yōu)越性和可行性幾乎已達成共識。因此，通過制備禽類輸卵管生物反應器生產(chǎn)HSA 將會呈現(xiàn)美好的前景。但是目前要制備禽類輸卵管生物反應器高水平表達外源基因，還存在很多困難和問題，嚴重制約了禽類輸卵管生物反應器的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，構(gòu)建一個高效真核表達載體，然后采用一定基因?qū)敕椒?，來制備轉(zhuǎn)基因動物，并使外源基因能在禽類輸卵管組織中特異性表達就顯得十分重要。

卵清蛋白是蛋清中含量最高的蛋白，它的5’調(diào)控成分具有組織特異性，并受到激素的誘導，具有很強的表達活性。試驗以流產(chǎn)胎兒肝臟組織為材料提取總RNA，用上游引物ALBF 與下游引物ALBR 進行PCR 擴增，獲得編碼HSA的基因，并對其進行序列測定與分析。再利用鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)構(gòu)建HSA 基因能在鵪鶉輸卵管乳腺中特異性表達的質(zhì)粒載體，以期為下一步的細胞轉(zhuǎn)染和將來通過體細胞核移植法制備禽類輸卵管生物反應器打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 流產(chǎn)胎兒肝臟組織。

1.2 菌種和質(zhì)粒 宿主菌DH5a為本室保存；質(zhì)粒Pov（含有鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)序列）由本實驗室提供；載體pIRES2-EGFP 購自Promega 公司；質(zhì)粒pGEM-T Easy Vector 購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 試劑

人血清蛋白基因克?。核靡镉缮虾Ｉ锕び邢薰竞铣?；DNAMarker、TRIzol 試劑、DEPC 水均購自百泰克公司；RT-PCR 試劑盒ThermoscrioptTM、凝膠回收試劑盒為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒（Omiga）、限制性內(nèi)切酶XhoI、T4 連接酶均購自Promega 公司；2×Pfu PCR MasterMix為北京天為時代科技有限公司產(chǎn)品。

人血清白蛋白真核表達載體的構(gòu)建：T4DNA 連接酶購自Promega 公司；各種限制性內(nèi)切酶、Long Taq 酶、dNTP、DNAMarker 均購自大連寶生物工程有限公司；凝膠回收試劑盒為上海生物工程有限公司產(chǎn)品，質(zhì)粒抽提試劑盒（Omiga）購自Promega 公司。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 人血清白蛋白基因的克隆 從GenBank 中查到ALB的cDNA 序列NM_000477，借助計算機引物設計軟件，設計了2條引物。引物序列如下（Xho I 酶切位點）。

上游引物：5’-CCGCTCGAG ATGAAGTGGGT AACCTTTATTTC-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAG TTATAAGCCTAA GGCAGCTTGAC-3’。

保護堿基+酶切位點+加同源區(qū)，用Trizol 法提取樣品總RNA，進行RT-PCR。以人源肝臟cDNA 文庫為模板，進行PCR 擴增。

取10μL 以上PCR 產(chǎn)物，加入1μL dNTP，2μL PCR buffer 及1μL 普通PCR Taq 酶，再加適量的水至終體積為20μL。72 ℃反應10 min，使PCR 產(chǎn)物加A 尾。取7μL 反應產(chǎn)物，pGEM-T 載體、T4 DNA 連接酶、10×buffer 各1μL，連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α 感受態(tài)細胞中。涂布于LA 平板，37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h，挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒并酶切鑒定。

酶切鑒定呈陽性的菌落均送英駿公司測序，以測序結(jié)果來判斷ALB 在載體上的連接方向，選擇正確連接的質(zhì)粒進行下一步試驗。

1.5 真核表達載體構(gòu)建為了保證能下一步與含有鵪鶉卵清蛋白5‘序列的質(zhì)粒載體順利融合，在引物SE5'端添加限制性內(nèi)切酶kpnⅠ酶切位點，AE5'端添加限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切位點，合成引物SE和AE：

SE：5′-CCGGGTACC ATGAAGTGGGTAACCTT TATTTC-3'；

AE：5′-CCGAAGCTTT TTATAAGCCTAAGGCA GCTTGAC-3'。

HESAcDNA 基因的PCR 擴增，kpnⅠ/ HindⅢ雙酶切質(zhì)粒pOV、pHSA，回收產(chǎn)物，用T4 連接酶定向連接并進行酶切鑒定。酶切、回收、連接、鑒定均按說明書進行。

質(zhì)粒pOV-HSA和pIRES2-EGFP 空載體酶切處理，快速回收酶切產(chǎn)物，然后將兩者混合后加入T4 DNA 連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，涂布于LA 平板，培養(yǎng)12～16 h 后挑取單菌落陽性克隆，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。酶切、回收、連接、提取純化、鑒定均按說明書進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 人肝臟組織總RNA 完整性和HSA 基因cDNA的RT-PCR 以人工流產(chǎn)胎兒肝臟組織為材料，提取總RNA，完整性較好，可以用于后續(xù)試驗，電泳結(jié)果見圖1。并以RT-PCR 方法擴增出HSA 基因1 800 bp 左右的cDNA，全長與預期大小一致，無干擾，表明是特異性擴增，凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖1 總RNA的甲醛變性電泳

圖2 PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.2 pGEM-T-ALB 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收RT-PCR 產(chǎn)物目的帶，將其與T 載體連接并轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a，在含Amp 并預先涂布IPTGIX-Gal的LB 平板上篩選，挑取白斑提取質(zhì)粒。用kpnⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切鑒定，切下了分別為約3.0 kb、1.8 kb 大小的條帶(圖3)，前者與載體大小相符，后者與HSA cDNA條帶的大小一致，結(jié)果與預期相符，這說明HSA cDNA 已成功克隆到T 載體上，獲得了陽性重組質(zhì)粒pTH。

圖3 重組質(zhì)粒酶切圖譜

2.3 HSA cDNA 測序 測序結(jié)果經(jīng)BLAST 軟件分析，與Genbank 中報道的HSA 基因有97%的同源性。個別堿基缺失，但整個讀碼框并未改變，保證了最大的讀碼框。序列分析表明，已成功克隆HSA cDNA 序列，可以用于表達載體的構(gòu)建。見圖4。

圖4 改造的HSA cDNA 克隆序列的比較分析

2.4 人血清白蛋白基因的改造 以克隆有HAS cDNA的質(zhì)粒pHSA為模板，通過特異性引物的擴增，在HAS cDNA的兩端添加了kpnⅠ和HandⅢ酶切位點，并與PGEM-T 載體連接后亞克隆，用雙酶切鑒定，約產(chǎn)生1 800 bp和3 000 bp的片斷，表明改造成功，結(jié)果見圖5。

2.5 HSA 初級表達載體pH-OV的構(gòu)建 利用kpnⅠ和HndⅢ酶切pOV和pHE 結(jié)果如下：將pHESA切為大小約1.8 kb和3.0 kb的兩段，其中小片段為HESA；將pOV 切為兩段，其中大片段含有鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分；并且將重組pH-OV 用kpnⅠ和HndⅢ雙酶切得到結(jié)果小片段HESA和含有鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分大片段，和預期結(jié)果一致，表明HSAcDNA和鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分成功的融合，得到HSA 初級表達載體pH-OV。見圖6。

圖6 初級表達載體PH-OV的構(gòu)建過程

2.6 人血清白蛋白真核表達構(gòu)建的結(jié)果 利用Xho I/kpnI 雙酶切重組質(zhì)粒PH-OV和載體IRES2-EGFP 結(jié)果如下：將重組質(zhì)粒PH-OV 切為大小兩段，其中大片段為僅含有目的基因HESA和鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分的片段；將IRES2-EGFP 切開后，大片段為含有EGFP 報告基因和kan 抗性基因的片段。利用XhoI 單酶切pEGFP-VH 并以IRES2-pEGFP-VH 做PCR。酶切鑒定和PCR 鑒定后均表明，酶切后實現(xiàn)了定向連接，人血清白蛋白輸卵管表達基本構(gòu)件成功的定向克隆在真核表達載體IRES2-EGFP的多克隆位點區(qū)XhoI 之后，鵪鶉卵清蛋白5'調(diào)控成分驅(qū)動的人血清白蛋白輸卵管特異性表達載體IRES2-pEGFP-VH 構(gòu)建成功，簡命名為pEGFP-VH，見圖7。

圖7 重組質(zhì)粒pEGFP-VH 構(gòu)建結(jié)果

3 討論

在研究禽類輸卵管生物反應器方面，主要研究禽類卵清蛋白調(diào)控區(qū)調(diào)控機制，通過卵清蛋白的調(diào)控成分，來啟動外源基因特異的在輸卵管上皮細胞的高效分泌表達。Sanders等［6］和Park等［7］把不同長度的卵清蛋白基5’因端調(diào)控區(qū)構(gòu)建在報告基因的上游，導入培養(yǎng)的原代輸卵管細胞，通過報告基因的表達情況，研究卵清蛋白基因5’端調(diào)控區(qū)的順式調(diào)控元件和反式作用因子等調(diào)控元件，并作出了卵清蛋白調(diào)控的大體模型。Haecker等［8］也用同樣的方法通過輸卵管細胞表達報告基因?qū)β亚宓鞍谆?’端調(diào)控區(qū)的各元件進行了更詳細的研究，激素依賴性調(diào)控元件(SDRE)和反式調(diào)控因子(NRE)被定位且功能進一步明確。在該研究基礎上，Ochiai等［9］把1.35 kb 長的卵清蛋白基因5’調(diào)控區(qū)調(diào)控的人促紅細胞生成素(hEPO)基因通過電穿孔法導人原代輸卵管上皮細胞，探討了hEPO 基因轉(zhuǎn)錄的可能性；宇麗等［10］把1.1 kb的卵清蛋白5’端調(diào)控區(qū)調(diào)控的CAT基因通過脂質(zhì)體技術(shù)，轉(zhuǎn)染雞原代輸卵管上皮細胞和雞成纖維細胞。結(jié)果在雞原代輸卵管上皮細胞轉(zhuǎn)染48 h 后檢測到了外源基因。鄭新民等［11］采用顯微注射法，使含有豬血清白蛋白側(cè)翼序列的微小人血清白蛋白基因?qū)胴i的基因組中，生產(chǎn)出轉(zhuǎn)人血清白HSA 基因豬，經(jīng)PCR和Southern 雜交檢測，4 頭活仔整合有HSA 基因，其中3 頭不同程度表達了人血清白蛋白。在轉(zhuǎn)基因小鼠方面，曹新等［12］所構(gòu)建的pcDNA3.1-6.7hALBm 表達載體行尾靜脈注射直接轉(zhuǎn)染哺乳期母鼠的活體組織。通過RT-PCR 檢測hALBm 基因在小鼠幾種組織中的表達來研究該構(gòu)建體的組織特異性。結(jié)果表明構(gòu)建體在受試鼠組織中的表達顯示了較好的乳腺組織特異性。以上說明無論是輸卵管生物反應器還是乳腺生物反應器構(gòu)建具有較長5’端上游乳蛋白調(diào)控區(qū)的輸卵管（乳腺）特異性表達載體對組織特異性表達是必需的。

本試驗將HAS 目的基因與鵪鶉卵清蛋白5’調(diào)控區(qū)成功定向連接，為調(diào)控人血清白蛋白基因的分泌表達奠定了基礎。就表達的載體總的結(jié)構(gòu)看，本實驗采用真核表達載體IRES2-EGFP 進行重組載體的構(gòu)建。IRES2-EGFP 載體自身帶有能發(fā)出綠色熒光的增強型綠色熒光蛋白報告基因紫外線的激發(fā)下發(fā)出明亮的綠色熒光，其表達的綠色熒光蛋白可以在熒光顯微鏡下直接觀測，該蛋白還可與其他蛋白在N 及C 端融合表達，其表達均不受影響。增強型綠色熒光蛋白是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其產(chǎn)生的熒光較普通綠色熒光蛋白強35倍，大大增強了其報告基因的敏感度，無種系依賴性，熒光強度、靈敏度及穩(wěn)定性強，應用廣泛。其序列中還含有CMV 強啟動子和SV40 polyA 加尾信號，前者可增強外源基因的表達，后者可增強mRNA的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄效率。此外，該載體攜帶的新霉素抗性基因，提供了抗生素G418 篩選的標志，便于轉(zhuǎn)染細胞的篩選。而且報告基因EGFP的存在使陽性的篩選和純化變得快速、簡便和直觀。在上游啟動子5'端前有終止密碼子，很好地避免了報告基因和目的基因的融合表達，從而保證了將來表達和分泌的人血清白蛋白的生物活性不受影響。

［1］茍德明，鄭新民，陳乃清.人血清白蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的制備［J］.中國獸醫(yī)學報，1996，16(6):570-575.

［2］黃淑幀，黃英，陳美壓，等.轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因試管牛的研究［J］.遺傳學報，2000，27(7):573-579.

［3］Miasanori S，Noboru M，Shintaro Y.A cDNA coding for human normal serum albumin and processfor production of the albumin［P］.Japan:EP 0330451，1989-08-30.

［4］Brash I，F(xiàn)aerman A，Baruch A，et al.Synthesis and secretion of human serum albumin by mammarygland exlants of virgin and lactating transgenic mice［J］.Transgenic Res，1993(2):266-276.

［5］Carter D C，He X M，Munson S H，et al.Three-dimensional structure of Human serum albumin［J］.Science，1989，244:1195-1198.

［6］Sanders M M，Mcknight G S.Positive and negative regulatory elements control the steroed-responsive ovalburnin promotor［J］.Biochemistry，1982，27:6550-6557.

［7］Park H M，Okumura J，Muramatsu T.Modulation of transcriptional activity of the chicken of albumin gene prornoter in primary cultures of chicken oviduct cells:effects of putative regulatory elements in the 5'-flanking region［J］.Biochem Mol Biol，1995.36(4):811-816.

［8］Haecker S A，Muramatsu T，Sensenbaugh K R，et al.Repression of the ovalbumin gene involves multiple negative elements including a ubiquitons transcriptional silencer［J］.Mol Endocrinol，1995，9(9):1113-1126.

［9］Ochiai H，Park H M，Nakamura A，et al.Synthesis of human erythropoietin in vivo in the oviduct of laying hens by localized in vivo gene transfer using electroporationl［J］.Poult Sci，1998，77:299-302.

［10］宇麗，趙君，張艷玲，等.雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列表達載體的構(gòu)建及其在雞原代輸卵管上皮細胞及雞成纖維細胞的表達［J］.中國獸醫(yī)學報，2001，21(1):21-24.

［11］鄭新民，魏慶信，喬憲鳳，等.表達人血清白蛋白轉(zhuǎn)基因豬的研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2003，16(1):199-121.

［12］曹新，曾溢滔.山羊β-酪蛋白基因啟動子指導人血清白蛋白基因在小鼠組織中的特異性表達［J］.遺傳，2001(6):518-520.