復(fù)方茵陳制劑對小鼠肝功能生化指標的影響

俞 芳 福建省福清市畜牧獸醫(yī)中心龍山畜牧獸醫(yī)站 350300

肝臟是動物體內(nèi)體積最大的實質(zhì)性腺體和重要的代謝器官，它不僅參與物質(zhì)代謝、生物轉(zhuǎn)化(解毒與滅活)、凝血物質(zhì)的生成和消除、膽汁的生成與排泄等等，而且因為其豐富的單核吞噬細胞，在特異和非特異免疫中也具有重要的作用。另外，肝臟在維持血糖水平相對穩(wěn)定的過程中起著關(guān)鍵作用，它可將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原儲存起來，也可將儲存的肝糖原分解成葡萄糖參與氧化功能以及參與動物體生長發(fā)育的調(diào)控［1］。

近來養(yǎng)殖業(yè)中的動物肝病明顯增多。如乳牛、黃牛暴發(fā)的乙型肝炎；雞可發(fā)生乙型肝炎，脂肪肝綜合征；雛鴨病毒性肝炎、乙型肝炎；豬、羊、家兔均可發(fā)生乙型肝炎。而且發(fā)展迅猛，如雛鴨病毒性肝炎［2］，是一種高度致死性傳染病，在福建、江西等國內(nèi)養(yǎng)鴨比較集中的省區(qū)均有該病大規(guī)模發(fā)生和流行，發(fā)病率高達70%，死亡率高達85%。這些都嚴重威脅著養(yǎng)殖業(yè)主的經(jīng)濟利益和人們的健康。因此，對動物肝臟疾病的有效治療和控制，是廣大獸醫(yī)科技工作者亟待解決的問題。試驗以四氯化碳（CCl4）引起的急性肝損傷為對照組，比較檢測服用復(fù)方茵陳制劑后對動物肝臟中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）指標的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 復(fù)方茵陳制劑，每克顆粒含0.564 g總藥材（生藥），由福建農(nóng)林大學(xué)動物科技研究所制；聯(lián)苯雙酯滴丸，北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)，每丸1.5 mg，批號03120105。

1.1.2 試驗動物 KM 小鼠，體重18～22 g，雌雄兼用，由福建醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心提供。

1.1.3 儀器和試劑 紫外分光光度計VIS-7220，北京瑞利分儀儀器公司；高速冷凍離心機Anke TGL-16G，飛鴿公司；微量移液器，德國eppendorf 公司；離心管（1.5 mL），由福建農(nóng)林大學(xué)藥品試劑科提供；Stotorius BS210S 電子天平(d=0.1g)，北京塞多利斯天平有限公司。CCl4、花生油、AST 、ALT 試劑盒均購自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗前準備及分組 將實驗小鼠60 只隨機分為6 組，每組10 只，稱重。①為正常對照組（Ⅰ組，生理鹽水，0.3 mL/10g）；②CCl4模型組（Ⅱ組，生理鹽水，0.3 mL/10g）；③聯(lián)苯雙酯陽性對照組（Ⅲ組，2 mg/10g）；④～⑥為復(fù)方茵陳顆粒制劑高、中、低劑量組（Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組，按臨床成人50 kg 每日31 g生藥量的5倍、10倍、15倍折算為小鼠給藥量，分別為16.5 g/kg 體重、11 g/kg 體重、5.5 g/kg 體重）。正式試驗前，所有動物禁食不禁水12 h，用蒸餾水將復(fù)方茵陳顆粒配制成所需濃度的藥液，將CCl4用花生油稀釋成所需濃度。

1.2.2 模型的制備和給藥 給藥組每天灌胃給藥1 次，連續(xù)4 d，空白組和模型組灌同等體積生理鹽水。于給藥第3 d，除正常對照組外，其余5 組頸部皮下注射0.5%四氯化碳-花生油溶液（0.1 mL/10g），注射后禁食不禁水，16 h 后模型建立。

1.3 檢測指標和方法 注射CCl416 h 后立即進行眼眶采血，肝素抗凝，4 000 r/min 離心10 min，用微量移液器取上清液，裝入離心管，標記。

AST、ALT的測定。分別吸取0.1 mL/支上清液，加入0.5 mL 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液均勻混合，37 ℃水浴30 min，再加0.5 mL 2，4-二硝基苯肼液，混勻后，37 ℃水浴20 min，之后加入5 mL 0.4 mol/L氫氧化鈉溶液，室溫放置10 min。在505 nm 波長，1 cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管的吸光度值，計算測定管（50 管）吸光度值與空白對照管（10 管）吸光度值差值，查標準曲線，求得相應(yīng)的AST 活力單位，記錄。

ALT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）測定的操作過程同AST 測定，求得相應(yīng)的ALT 活力單位，記錄。

1.4 統(tǒng)計方法 結(jié)果采用SPSS11.0 統(tǒng)計軟件，用方差F 檢驗、LSD 法比較組間和組內(nèi)差異顯著性。

2 結(jié) 果

觀察復(fù)方茵陳制劑對急性肝損傷小鼠血漿酶指標的影響。由表1 可知，注射CCl416 h 后，II 組小鼠的血漿AST、ALT 比I 組分別提高111.63%和847.14%，差異極顯著（P＜0.01），說明肝功能明顯受損，造模成功。

用藥Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組的血漿AST 分別比II 組降低38.10%、32.23%、28.21%，差異極顯著（P＜0.01）。用藥Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組的血漿ALT 分別比II組降低72.25%、42.99%、34.24%，差異極顯著（P＜0.01）。

堿性磷酸酶（AKP）除Ⅲ組與I 組比較有顯著性差異外，其余組間均不存在顯著性。

表1 藥物對小鼠肝損傷血漿AST、ALT的影響（n＝10，±SD）

3 討論

3.1 肝損傷模型的選擇 最近幾年常用的動物肝臟疾病模型有化學(xué)藥物中毒性肝炎模型（主要包括CCl4肝損傷模型、D-氨基半乳糖胺急性肝損傷模型、硫代乙酰胺肝損傷模型、α-萘異硫氰酸酯肝損傷模型、撲熱息痛肝損傷模型、異硫氰酸苯酯和硝硫氰胺肝損傷模型）、免疫性肝損傷模型（卡介苗免疫性肝損傷模型、脂多糖免疫性肝損傷模型）和其他肝損傷模型［3］。復(fù)方茵陳制劑主要是保肝降酶作用，所以，選擇CCl4急性肝損傷模型。而且CCl4是長期以來公認的復(fù)制肝損傷動物模型的化學(xué)物質(zhì)，我國衛(wèi)生部頒布的《中藥藥理實驗指導(dǎo)原則》中明確指定應(yīng)用CCl4肝損傷動物模型進行保肝降酶新藥的藥理實驗，其模型成功率高，試驗方法簡便，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定［4］。

3.2 陽性對照組藥物的確立 目前臨床用于治療各種急性、慢性肝炎，已獲得藥品批準文號的中成藥和西藥均可以作為陽性對照藥?；瘜W(xué)合成藥聯(lián)苯雙酯，是合成無味子丙素的一種中間體，對動物有抗肝損傷作用，能增強肝臟解毒功能，臨床對肝炎病人肝功能障礙有治療作用，特別是降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用顯著，優(yōu)于國內(nèi)外同類藥品，已成為實驗室研究的陽性對照藥［5］。

3.3 肝功能生化實驗指標檢測 肝臟是人體物質(zhì)代謝的中心器官，行使著多種重要的代謝功能。肝細胞除了具有一般細胞所共有的代謝功能外，還有一些特殊的代謝功能，肝功能實驗方法不下500 余種，但臨床常用的肝功能不過幾十種。血清中的AST、ALT 活力升高與肝組織損傷程度和范圍呈平行關(guān)系。整個肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的量約為血清中的100倍，因此，只要1%的肝細胞壞死便足以使血清中活性增加一倍。又由于肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶濃度比血清高1 000～5 000倍，當肝組織發(fā)生炎癥和損傷時，因能量代謝障礙而致細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶也可由于濃度梯度而泄漏入血，因此，血清轉(zhuǎn)氨酶活性是肝細胞損害的最敏感指標。

3.4 復(fù)方茵陳制劑對小鼠急性肝損傷的保護作用復(fù)方茵陳制劑是提取茵陳、黃芩、大黃、甘草等有效成分研制而成的復(fù)方中藥制劑。諸配方不僅充分發(fā)揮著本身的藥效作用，還互相配合，具有疏肝解郁，活血行氣散結(jié)之功能：（1）茵陳含有篙屬香豆素、色原酮類、茵陳二炔、脂肪油及茵陳多肽等有效成分，具有利膽作用；抗肝損傷作用；解熱鎮(zhèn)痛、消炎作用；免疫調(diào)節(jié)作用［5］。（2）黃芩，其含有的黃芩苷有降壓作用，降血脂作用，對由各種原因造成肝損傷動物模型具有明顯的保護作用；黃芩素是一個很好的黃嘌呤氧化酶抑制劑，可用于治療肝炎，另外還有很強的抗氧化、抗腫瘤作用。（3）大黃具有清除肝細胞炎癥和膽汁淤積，清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護肝臟功能的作用［6］。（4）甘草可緩急止痛，調(diào)胃和肝。對四氯化碳所致的肝損傷有明顯保護作用，可減輕肝細胞變性和壞死，降低血清轉(zhuǎn)氨酶活力。明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用。另外，還有抗炎、抗病毒、抗致突、解毒和抗氧化作用。

通過研究復(fù)方茵陳制劑對CCl4引起急性肝損傷整體模型的影響，發(fā)現(xiàn)其各劑量組均能不同程度明顯降低血漿AST、ALT等酶的含量，減輕肝臟的病理性損傷，表現(xiàn)出明確的保肝作用。

另外，芮箐等［7］報道了復(fù)方茵陳膠囊的利膽、降脂作用及對四氯化碳、α-異硫氰酸氖酯所致的肝損傷具有顯著的保護作用，能增加膽汁分泌，血清轉(zhuǎn)氨酶活性明顯降低。蘇立盛等［8］報道中藥肝靈對大鼠急性肝損傷的保護作用，并說明其保肝機理為保護肝細胞膜，抗脂質(zhì)過氧化，促進蛋白合成，調(diào)節(jié)免疫。這些都與本試驗的結(jié)果相一致。

4 總結(jié)

隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，抗生素和化學(xué)藥物對動物的危害越來越受到人們的重視。而中草藥添加劑將進入一個新的發(fā)展階段，因為它獨特的作用方式、良好效果、無殘留、無抗藥性以及無污染而使其成為一種理想的飼料添加劑。

［1］李儀奎，王欽茂.中藥藥理試驗方法學(xué)［M］.上海:科學(xué)技術(shù)出版社，1991:382.

［2］萬雪，王磊，寧官保，等.鴨病毒性I 型肝炎研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2005，32(8):57-59.

［3］黃正明，楊新波，曹文斌，等.化學(xué)性及免疫性肝損傷模型的方法學(xué)研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2005，21(1):42-46.

［4］張琪，陳輝，彭順利，等.急性肝損傷動物模型具備研究進展［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2011，8(4):216.

［5］陳奇.中藥藥理試驗方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:837.

［6］張沛毅.當歸對試驗性肝損傷小鼠的抗自由基損傷作用［J］.中西結(jié)合肝病雜志，1996，6(4):21-22.

［7］芮箐，吳燕敏.復(fù)方茵陳膠囊的藥效學(xué)研究［J］.天津藥學(xué)，2004，16(1):7-9.

［8］蘇立穩(wěn)，盛國光，張建軍，等.中藥肝靈對大鼠急性肝損傷保護作用的試驗研［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1998，15(1):9-11.