球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

謝 翎1,2，黃 勃2

(1.安慶師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽安慶 246011；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院，安徽合肥 230036)

酵母作為真核單細(xì)胞生物，兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點。與原核生物表達(dá)體系相比，利用酵母對外源基因進(jìn)行真核表達(dá)具有諸多優(yōu)勢：繁殖迅速，培養(yǎng)廉價；酵母結(jié)構(gòu)簡單，便于進(jìn)行異源基因的遺傳操作；具有蛋白翻譯后修飾能力[1]；可在信使RNA翻譯時去甲硫氨酸，避免藥物使用中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。目前技術(shù)最成熟，應(yīng)用最多的酵母表達(dá)系統(tǒng)是畢赤酵母（Pichia pastoris）。

pPIC9K質(zhì)粒含有kan基因，使畢赤酵母具有G418抗性。G418抗性水平主要依賴整合的kan基因的數(shù)目。kan基因與表達(dá)盒間具有遺傳連鎖，因此從G418抗性可推斷其所含有的插入基因拷貝數(shù)。

目前，國內(nèi)外利用這種表達(dá)體系已成功表達(dá)多種異源蛋白[2-3]。但迄今為止，關(guān)于昆蟲病原真菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1在畢赤酵母中實現(xiàn)真核表達(dá)的研究還未見報道。本研究首次構(gòu)建了球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表達(dá)載體，為海藻糖-6-磷酸合成酶的蛋白研究及大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株與質(zhì)粒

含球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1的質(zhì)粒PMD18-T/Bbtps1，由實驗前期構(gòu)建。分泌型真核表達(dá)穿梭載體pPIC9K與大腸桿菌JM109菌株由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

TaqDNA聚合酶、PMD18-T載體、DNA膠回收試劑盒均購自大連寶生物公司。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 Bbtps1基因的真核表達(dá)載體pPIC9K/tps1的構(gòu)建

根據(jù)球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1序列及真核分泌型表達(dá)載體pPIC9K表達(dá)框及多克隆插入要求，設(shè)計上游引物TPS1BD1，下游引物TPS1BD2。通過PCR反應(yīng)從質(zhì)粒PMD18-T/Bbtps1（由前述實驗構(gòu)建）中擴增出帶EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點的Bbtps1 cDNA全長序列。

下劃線部分序列分別帶有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ的識別位點。

根據(jù)特異引物TPS1BD1、TPS1BD2對PMD18-T/Bbtps1質(zhì)粒進(jìn)行擴增。

酶切后的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K與目的基因片段用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α，轉(zhuǎn)化菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上過夜，挑選陽性克隆子用插入基因特異引物TPS1BD1、TPS1BD2進(jìn)行PCR鑒定并送測序。

1.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

制備方法參照《Molecular Cloning》所介紹的CaCl2法[4]。

1.2.3 DNA回收及克隆、測序

在紫外燈下切下含目的片段的凝膠塊，用takara的膠回收試劑盒回收DNA?；厥掌伟丛噭┖姓f明書連接到PMD18-T載體上。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及克隆轉(zhuǎn)化具體方法參考《分子克隆實驗指南》。陽性轉(zhuǎn)化子委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 序列分析

序列分析用DNAMAN軟件和NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上的BLAST程序完成。

2 結(jié)果與分析

在構(gòu)建Bbtps1表達(dá)載體pPIC9K/tps1過程中，首先，擴增球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1 ORF的cDNA序列（1563bp，兩邊分別帶EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點）。將其雙酶切后，通過T4連接與同樣經(jīng)過雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K，構(gòu)成質(zhì)粒pPIC9K/tps1，轉(zhuǎn)化DH5α。通過引物TPS1BD1、TPS1BD2對重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了PCR鑒定（圖1），同時挑取PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序。序列分析結(jié)果表明，Bbtps1基因被正確地插入到pPIC9K質(zhì)粒的表達(dá)框中。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K/tps1 PCR檢測

重組質(zhì)粒pPIC9K/tps1全序列測定結(jié)果:

TGAAGCTTACGTAGAATTCATGTCCACCCCGGCAGAGACTCAGCAAGAGGCTGCTGCGCCCGGCCGTCTT CTGCTACTCTCGAACCGTCTGCTCATTGGCAGCTATACCTTTTCCATGTCCTCTGGTGGCCTTGTGACTGGCCTGA GCGGTCTGAGCAAGACCACCAGCTTCCAGTGGTGCGGATGGCCCGGCCTTGAGGTACCCGAGAACGAGGTCGA TGGCATGAAGAAACGCCTCAAAGCAGAGTACGGCGCGCATCCCGTCTTTATCGACGATGAGCTCGCTGACCGCC ACTACAATGGGTTTGCCAATTCTATCCTCTGGCCGTTGTTCCACTATCACCCCGGTGAAATCACCTTTGACGAGT CTGCCTGGGTCGCCTACCAAGAAGTCAACCGCCTCTTTGCGCAGACTGTCATCAAAGATGTTCAAGACGGTGAT CTAATCTGGGTGCACGACTACCATCTGATGCTTCTGCCCCAGATGTTGCGCGAGGAAATTGGCAACTCCAAGAA GAACGTCAAGATCGGCTTCTTTTTGCACACGCCATTTCCAAGTAGCGAAATTTACCGCATTCTGCCTGTCCGCGA GCCTCTTCTCACAGGTCTTCTCGATTGCGACCTGATTGGCTTCCACACATACGACTACGCGCGCCACTTCCTTAGT AGTTGCTCGCGCATACTCGGCACCCCCACCACCCCCAACGGTGTCGATTGGAATGGCCGCTTCGTGACTGTCGG GGCGTTTCCTATTGGAATAGACCCCGAAAAGTTTGTCGAGGGGTTGAAGCAACCCAAGGTGCAGGCGCGCATC GCAGCTCTGAAACGCAAGTTTGAAGGCGTGAAGCTCATTGTCGGCGTCGATCGTCTCGACTACATCAAGGGTGT GCCGCAAAAACTTCATGCCCTCGAGGTTTTCCTCACGGAGCACCCCGAGTGGATTGGCAAGATTGTCCTCGTCC AGGTTGCCGTGCCCTCACGCCAGGATGTCGAAGAGTACCAGAACCTGCGTGCCGTTGTCAACGAGCTCGTCGGC CGCATCAACGGCAAGTTTGGCACCATTGAATTTATGCCCATCCACTTTTTGCACCAGTCCGTGTCCTTTGACGAG CTGACGGCGCTCTACGCTGTGTCGGACGTGTGCCTGGTGTCTTCCACTCGTGATGGCATGAACCTCGTCTCGTAC GAGTACATTGCCACGCAGCGCGAGAAGCACGGCGTCATGATCCTCAGCGAGTTTACCGGCGCCGCGCAGTCGC TCAACGGCAGTCTGATTGTTAACCCCTGGAACACGGAGGAGCTAGCCAACGCCATCCACGACGCCGTGACCAT GAGCCCCGAGCAGCGCGCCGCCAACTACAGCAAGCTCGAGCGCTATGTCTTCAAGTACACGAGCGCTTGGTGG GGGGCCACCTTTGTCGCCGAGATGACGCGCCTCAGCAACGAGGAGTCGCAGGCAAAGACGATTCGCAATGTCT CGGGTGCCGTGGTCAGCTCGGGCCAAAAGGCACTGACAGAAGAGCCCGAGAACAAGGAGCCGGAGGCGAATC AAGCGGAATGAGCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACT

兩個方框是使用的限制性酶切位點，陰影部分之間是插入的TPS1基因序列。限制性酶切位點之外，是原始質(zhì)粒pPIC9K的序列。

3 討論

由于巴斯德畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，因此需要使用整合型質(zhì)粒作為外源插入基因的表達(dá)載體。其表達(dá)載體通常包括AOX1啟動子（5’AOX1）、多克隆位點、AOX1轉(zhuǎn)錄終止子（AOXt）、組氨酸脫氫酶基因his4、3’AOX1以及來自大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的大腸桿菌復(fù)制序列。而整合位點一般位于HIS4區(qū)或AOX1區(qū)。巴斯德畢赤酵母用來表達(dá)外源基因，具有雜蛋白少、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點[5]。它能對插入基因編碼蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，并分泌至細(xì)胞外[6-7]。其表達(dá)蛋白能夠被糖基化，類似于人類蛋白質(zhì)[8]，是一種較為理想的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

本研究針對球孢白僵菌的tps1基因,構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pPIC9K/tps1。通過PCR鑒定和測序表明，該重組質(zhì)粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全長cDNA序列。并且Bbtps1基因被正確地插入到了pPIC9K質(zhì)粒的表達(dá)框中。因此，該重組質(zhì)?？梢灾苯佑糜趖ps1基因的酵母表達(dá)。

[1]洪洄，王冬梅.應(yīng)用酵母進(jìn)行基因表達(dá)的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報，1999，34(7):12-14.

[2]CereghinoJL,CreggJM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMSMicrobiology Reviews,2000,24:45-66.

[3]Thor D,XiongS,OrazemCC,et al.Cloningand characterization ofPichia pastoris MET2 gene as a selectable marker[J].FEMS Yeast Research,2005,5(10):935-942.

[4]Sambrook J,Russell DW.Molecular Cloning[M].NewYork:Cold SpringHarbor LaboratoryPress,2001.

[5]Romanos M.Advances in the use ofPichia pastoris for high level gene expression[J].Current Opinion in Biotechnology,1995,6(5):527-533.

[6]HongF,Meinander NQ,Jonsson LJ.Fermentation strategies for improved heterologous expression oflaccase in Pichia pastoris[J].Biotechnologyand Bioengineering,2002,79(4):438-449.

[7]Sreekrishna K,Brankamp RG,Kropp KE,et al.Strategies for optimal synthesis and secretion ofheterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Gene,1997,190(1):55-62.

[8]Duman JG,Miele RG,HongL,et al.O-Mannosylation ofPichia pastoris cellular and recombinant proteins[J].Biotechnologyand Applied Biochemistry,1998,28(1):39-45.