高溫脅迫誘導龍牙楤木次生體胚發(fā)生過程中抗氧化酶活性變化1)

趙曉妮 孫鳳陽 尹 靜 由香玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

龍牙楤木(Aralia elata(Miq.)Seem.)，又名遼東楤木、刺老芽等，屬五加科楤木屬(Aralia L.)植物［1］，為重要的食、藥兼用的植物。其嫩芽含有人體必需的多種氨基酸和微量元素［2］，根皮和樹皮性味辛苦，有小毒，具有補氣安神、強精滋腎、祛風活血、除濕止痛的功效［3］。近年來的研究顯示龍牙楤木皂苷在免疫調(diào)節(jié)、腫瘤防治方面有很顯著的作用［4］。但是，龍牙楤木的野生資源由于破壞性、掠奪性地進行連年多茬采收，其資源量急劇下降，黑龍江省已將其列為瀕危珍稀植物，其高效繁殖也顯得尤為重要而迫切。

體胚發(fā)生方式是一種高效快繁方法。關于龍牙楤木體胚發(fā)生的研究報道已有不少，例如:Amemiya et al.［5］利用10年生龍牙楤木樹上的冬芽在含有2，4－D 的 MS 培養(yǎng)基中誘導產(chǎn)生了體胚;Kang et al.［6］在含2，4－D的培養(yǎng)基中，從龍牙楤木毛狀根中誘導了體胚;Dai et al.［7］利用IBA誘導了體細胞胚發(fā)生等?，F(xiàn)報道的研究主要是外植體選擇和利用植物生長調(diào)節(jié)劑建立體胚快速繁殖體系。在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫能夠誘導龍牙楤木次生體胚發(fā)生。高溫誘導體胚發(fā)生的實例有胡蘿卜和油菜，其中，37℃高溫處理胡蘿卜的頂芽后轉入無任何植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中誘導了體胚發(fā)生［8］;油菜花芽內(nèi)小孢子經(jīng)高溫處理后，誘導了前期體胚［9］。但研究者們未深入分析其中的原因，僅從體胚發(fā)生角度研究了這種誘導體胚發(fā)生的方法。事實上，高溫脅迫會使外植體各種生理狀態(tài)發(fā)生變化，其中一項重要的生理變化是抗氧化酶的變化。因為脅迫產(chǎn)生了大量的活性氧，可使細胞膜脂過氧化而傷害細胞［10］。文中詳細介紹了37℃高溫誘導次生體胚的過程，為高效快速繁殖龍牙楤木提供更簡便快捷的方法;同時考察了高溫處理過程中及次生體胚發(fā)生過程中3種抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)活性的變化特征，從生理活性角度揭示了高溫脅迫處理對體胚誘導的作用。

1 材料與方法

次生體胚誘導:本試驗在先前的研究中，通過無菌實生苗根誘導(在1/2SH+2.0 mg·L－1IBA+20 g·L－1蔗糖的固體培養(yǎng)條件下)獲得了大量龍牙楤木成熟子葉體胚［7］。從中選取1.5 cm長的成熟子葉體胚，接種于不含有任何植物生長調(diào)節(jié)劑，添加20 g·L－1蔗糖的WPM固體培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)0～3 d，取出放置于培養(yǎng)室進行暗培養(yǎng)誘導次生體胚。每個培養(yǎng)瓶中接種8個體細胞胚，每個處理接種10瓶。每次取0.2 g，每隔5 d取樣1次，共取5次，迅速放入冰箱－40℃保存，留作抗氧化酶活性分析。上述培養(yǎng)基均添加3 g·L－1水晶洋菜(gelrite，Duchefa－Postubus Haarlem，Netherlands)，pH 值為5.8，經(jīng)過高溫高壓滅菌(121 ℃、0.152 MPa、15 min)后使用。材料在常規(guī)組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)(溫度(23±1)℃，暗培養(yǎng)，濕度60% ～70%)。

SOD、POD、CAT活性測定:將龍牙楤木體胚材料置于預冷的研缽中，加1.0 mL預冷的0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值為7.8)在冰浴上研磨成漿后，轉入離心管中加0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值為7.8)使終體積為 5.0 mL。然后在 4 ℃、10 000 r·min－1離心15 min，取上清液作為粗酶液于冰箱中4℃冷藏，用于測定超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性分析。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光還原法測定［11］;過氧化物酶(POD)活性采用0.3%愈創(chuàng)木酚法［11］測定;過氧化氫酶(CAT)活性采用240 nm比色法［11］測定。

數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)采用Excel 2003進行整理及作圖處理，應用SPSS19.0軟件進行Tukey多重比較分析和相關性分析，所得數(shù)據(jù)均為3次的平均值。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫誘導龍牙楤木次生體細胞胚發(fā)生

龍牙楤木成熟體細胞胚在恒溫培養(yǎng)箱中37℃處理0～3 d，接種于無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d，都有次生體細胞胚發(fā)生(圖1A、B、C)。觀察發(fā)現(xiàn)，在此過程中10～15 d是次生體細胞胚發(fā)生的時期，此后20～25 d基本是體細胞胚發(fā)育成長的時期。與未進行高溫處理的對照和處理1 d的外植體相比，高溫處理3 d的外植體材料變褐，且平均每個體胚上產(chǎn)生次生體細胞胚的數(shù)量較少，約2個(表1)。統(tǒng)計次生體胚的誘導情況(表1)顯示，高溫處理外植體1 d，次生體胚的誘導情況較好，誘導率和體胚誘導數(shù)量分別為58%和4個，顯著高于對照(P＜0.05);但是隨著高溫處理時間的延長，體胚的誘導率逐漸下降，均顯著低于對照(P＜0.05)，而且高溫處理3d的體胚誘導率略低于處理2 d的，無顯著差異(P＞0.05)。結果表明，合適的高溫脅迫有利于次生體胚發(fā)生。

圖1 成熟體胚經(jīng)高溫處理后在無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的WPM培養(yǎng)基中誘導的次生體胚

表1 高溫處理0～3 d的體細胞胚在無任何植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中誘導次生體細胞胚的情況

2.2 高溫脅迫誘導龍牙楤木次生體胚發(fā)生過程中抗氧化酶活性分析

2.2.1 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中SOD活性變化

經(jīng)高溫處理1～3 d的龍牙楤木體胚與未處理的相比，SOD活性都有所升高，但是升高幅度不大(取材時間為0 d)(表2)。在體細胞胚發(fā)生過程中，與對照相比，在第5 d SOD活性都有所下降，到第10 d時，SOD活性達到最高峰，之后各處理的SOD活性呈下降趨勢。第10～15 d是胚性細胞形成時期。在第5～10 d，未處理材料中的SOD活性都高于處理的;而在第15 d處理材料的SOD活性都高于未處理的。且整個次生體胚發(fā)生過程中，處理1 d外植體中SOD的活性均較高。

2.2.2 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中POD活性變化

龍牙楤木體胚經(jīng)高溫處理后，與對照相比，各個處理的POD活性均下降(取材時間為0～5 d)(表2)。處理后在次生體胚發(fā)生過程中，胚性細胞的形成時期，即第10 d POD活性迅速上升至最高，而且高溫處理1 d的POD活性最高，隨后其活性下降，且活性基本不變。表明POD活性升高可促進次生體胚發(fā)生和胚性細胞的早期發(fā)育，而高溫脅迫1 d更利于體胚發(fā)生的形成。

表2 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中SOD、POD、CAT活性變化

2.2.3 高溫脅迫處理及次生體胚發(fā)生過程中CAT活性變化

龍牙楤木體胚經(jīng)高溫處理后，與對照相比，各處理的CAT活性均呈下降趨勢(取材時間為0 d)(表2)。在次生體胚發(fā)生過程中，CAT活性逐漸升高，在第15 d CAT活性達到最高，而后其活性雖有小幅下降，但維持在一個較高的水平。高溫處理1 d外植體的CAT活性相對其他處理的較高，而且在次生胚性細胞形成期第15 d活性達到最高，其后維持在較高水平。由此可知次生體胚的發(fā)生發(fā)育過程中，CAT活性均升高。崔凱榮等［12］在研究枸杞的體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，CAT在繼代愈傷組織中的活性很高，隨著胚性細胞的形成酶活性降低，到分化培養(yǎng)3 d時出現(xiàn)酶活性的低谷，隨著胚性細胞的分裂、發(fā)育，這種酶活性又開始逐漸升高，成熟胚期活性升到和繼代愈傷組織大致相同水平。而與本研究體胚發(fā)生過程不太一致。可能由于本研究外植體材料預先進行的高溫脅迫改變了其變化趨勢。

通過對高溫脅迫處理后龍牙楤木體胚SOD、POD、CAT活性的變化進行Pearson相關性分析，得出POD與CAT活性之間的相關系數(shù)r=0.983，P=0.017＜0.05，表明兩者呈顯著正相關，且龍牙楤木體胚隨著高溫脅迫處理時間的延長，POD與CAT活性都顯著低于對照組(P＜0.05)，龍牙楤木體胚的POD與CAT完全失去保護作用;而SOD與POD、CAT活性呈一定的負相關，但不顯著(P＞0.05)，龍牙楤木體胚隨著高溫脅迫處理時間的延長，SOD活性略高于對照組，差異不顯著(P＞0.05)，表明高溫脅迫處理后龍牙楤木體胚中SOD可能對其活性氧的清除起到關鍵作用;在龍牙楤木次生體胚發(fā)生過程中3種抗氧化酶活性之間相關性不顯著。

3 結論與討論

植物體在遭受高溫脅迫后，細胞內(nèi)將積累大量的活性氧［13－15］，誘使細胞內(nèi)合成表達抗氧化酶類以消除或緩解活性氧對細胞的毒害作用。作為內(nèi)源性保護酶，SOD負責催化·轉變?yōu)镠2O2，并在過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)的作用下將其分解為H2O和O2，消除高溫脅迫產(chǎn)生的活性氧對細胞的傷害［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫龍牙楤木體胚誘導次生體胚發(fā)生過程中，3種抗氧化酶活性均有明顯變化。高溫脅迫均使POD和CAT活性降低，而SOD活性則升高。在次生體胚發(fā)生過程中，3種過氧化物酶活性均有顯著的變化。在胚性細胞分化的早期(第10、15 d)，處理外植體的POD、SOD活性相對較高，CAT活性較低。在體胚發(fā)育過程中(第15 d以后)，SOD和POD活性都呈顯著下降趨勢(P＜0.05)，而CAT活性維持在較高的水平。由此可推測，SOD和POD對次生體胚誘導起主導作用，而CAT對體胚的發(fā)育和成熟起關鍵作用。本試驗結果同時也表明，在次生體胚發(fā)生過程中，3種抗氧化物酶(SOD、POD、CAT)相互配合來調(diào)節(jié)胚性細胞的發(fā)生與發(fā)育過程，與陳義挺等［17］對龍眼體胚發(fā)生早期POD活性研究結果一致。處理1d外植體為合適的處理，其活性均高于其他處理，而其次生體胚誘導率相對較高。3種過氧化物酶活性的規(guī)律性變化，可能是在不同的細胞器中進行，從而使體胚發(fā)生過程氧化系統(tǒng)維持在一個適宜的水平，以消除高溫對體胚發(fā)生的影響。在花楸體胚發(fā)生過程中，研究者發(fā)現(xiàn)，SOD、POD活性均在胚性細胞向球形胚轉化時下降，球形胚向心形胚發(fā)育時下降，心形胚向魚雷形胚和魚雷形胚向子葉形胚發(fā)育時再升高;CAT活性變化規(guī)律與SOD、POD活性變化不同［18］，這可能是不同材料的體胚發(fā)生過程中抗氧化系統(tǒng)的協(xié)調(diào)方式不同所致。

許多資料顯示，一定濃度的H2O2對體胚產(chǎn)生有促進作用。枸杞體胚發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，適量濃度的H2O2對枸杞胚性細胞的形成和體細胞胚的發(fā)育有促進作用;過高的H2O2則有抑制作用［19］。本研究的高溫脅迫，同樣也產(chǎn)生了大量活性氧。H2O2作為一種細胞信號傳遞物質(zhì)，可以通過細胞的信號傳遞系統(tǒng)影響基因的調(diào)控表達。胚性細胞的形成過程，即細胞的分化過程，其核心是基因的差異表達，H2O2可能在分子水平上誘導胚胎的發(fā)生［12］。

崔凱榮等［12］在枸杞的體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，在胚性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基后，隨著胚性細胞的形成，SOD活性逐漸升高，當胚性細胞進一步分裂形成體細胞胚時，SOD活性達到最高峰，表明SOD活性升高對胚性細胞的分化及胚胎發(fā)育具有促進作用。原海云等［20］以連翹為試驗材料，研究高溫脅迫對連翹細胞SOD活性的影響發(fā)現(xiàn)，在12～24 h，高溫脅迫時間與連翹細胞SOD活性呈正相關，這與本試驗結果相一致。根據(jù)本試驗3種抗氧化物酶的相關分析表明，POD與CAT活性呈顯著正相關(r=0.983)，POD、CAT活性能夠準確地反映高溫脅迫龍牙楤木體胚發(fā)生隨處理時間的變化趨勢，這對研究龍牙楤木次生體胚的發(fā)生具有一定的指導意義。

［1］ 孫濤，張國榮，王彥，等.龍牙楤木的化學成分、藥理作用和食用價值研究進展［J］.人參研究，2009(1):24－25.

［2］ 吳立東，趙鳳珍.刺嫩芽資源的經(jīng)營利用［J］.林業(yè)勘查設計，2004(2):53.

［3］ 張淑慧，陳靜，趙智勇，等.龍牙楤木的研究概況［J］.黑龍江醫(yī)藥，2001，14(4):291－292.

［4］ Yagi-Chaves S N，Liu Gang，Yamashita K，et al.Effect of five triterpenoid compounds isolated from root bark of Aralia elata on stimulus-induced superoxide generation，tyrosyl or serine/threonine phosphorylation and translocation of p47(phox)，p67(phox)，and rac to cell membrane in human neutrophils［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2006，446(1):84－90.

［5］ Amemiya K，Mochizuki T.Somatic embryoformation and plant regeneration in‘Zaoh’line No.2 of Japanese angelica tree(Aralia elata Seem.)［J］.Plant Biotechnology，2002，19(5):383－387.

［6］ Kang H J，Anbazhagan V R，You Xiangling，et al.Production of transgenic Aralia elata regenerated from Agrobacterium rhizogenesmediated transformed roots［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2006，85(2):187－196.

［7］ Dai Jinling，Tan Xiao，Zhan Yaguang，et al.Rapid and repetitive plant regeneration of Aralia elata Seem.via somatic embryogenesis［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2011，104(1):125－130.

［8］ Kamada H，Kobayashi K，Kiyosue T，et al.Stress induced somatic embryogenesis in carrot and its application to synthetic seed production［J］.In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology-Plant，1989，25(12):1163－1166.

［9］ Pechan P M.Successful cocultivation of Brassica napus microspores and proembryos with Agrobacterium［J］.Plant Cell Reports，1989，8(7):387－390.

［10］ 尚慶茂，陳淑芳，張志剛.硒對高溫脅迫下辣椒葉片抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)作用［J］.園藝學報，2005，32(1):35－38.

［11］ Havir E A，McHale N A.Biochemical and developmental characterization of multiple forms of catalase in tobacco leaves［J］.Plant Physiology，1987，84(2):450.

［12］ 崔凱榮，任紅旭.枸杞組織培養(yǎng)中抗氧化酶活性與體細胞胚發(fā)生相關性的研究［J］.蘭州大學學報:自然科學版，1998，34(3):93－99.

［13］ 梁雪，顏坤，梁燕，等.高溫對耐熱大蔥品種PSⅡ和抗氧化酶活性的影響［J］.園藝學報，2012，39(1):175－181.

［14］ 盧瓊瓊，宋新山，嚴登華.高溫脅迫對大豆幼苗生理特性的影響［J］.河南師范大學學報:自然科學版，2012，40(1):112－115.

［15］ 鄧茳明，熊格生，袁小玲，等.棉花不同耐高溫品系的SOD，POD，CAT活性和MDA含量差異及其對盛花期高溫脅迫的響應［J］.棉花學報，2010，22(3):242－247.

［16］ Alscher R G，donahue J L，Cramer C L.Reactive oxygen species and antioxidants:relationships in green cells［J］.Physiologia Plantarum，1997，100(2):224－233.

［17］ 陳義挺，賴鐘雄，林玉玲，等.溫度對龍眼體胚發(fā)生早期POD活性及同工酶的影響［J］.中國農(nóng)學通報，2009，25(9):32－37.

［18］ 張建瑛，楊玲，沈海龍.花楸體細胞胚發(fā)生過程中抗氧化酶活性的變化［J］.植物生理學通訊，2007，43(2):264－268.

［19］ Kairong C，Gengsheng X，Xinmin L，et al.Effect of hydrogen peroxide on somatic embryogenesis of Lycium barbarum L.［J］.Plant Science，1999，146(1):9－16.

［20］ 原海云，姚延梼.高溫脅迫對連翹葉片SOD活性的影響［J］.天津農(nóng)業(yè)科學，2011，17(6):102－104.