輪葉黨參皂苷對二乙基亞硝胺致肝細(xì)胞DNA損傷的保護作用

鄭春姬，俞 星,2，韓春姬,2,*

(1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)食品研究中心，吉林 延吉 133002)

原發(fā)性肝癌成為世界第5個最常見的惡性腫瘤，在人類癌癥中占5.6%[1]，也是我國最常見的惡性腫瘤之一。盡管目前對肝癌的主要治療方法采取手術(shù)措施，肝癌死亡率仍很高。因此，研究肝癌發(fā)生早期階段的預(yù)防劑是非常必要的，尤其是選用天然無毒的化學(xué)預(yù)防劑是國內(nèi)外學(xué)者重視的課題。輪葉黨參(Codonopsis lanceolata)又名山海藻，屬于桔?？泣h參屬植物，廣泛分布于中國、韓國、朝鮮、日本等地。輪葉黨參主要是作為山野菜食用，未見任何毒副作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，輪葉黨參提取物具有抗氧化、抗衰老、抗突變、抗腫瘤、抗疲勞以及提高機體免疫力等作用[2-5]。本實驗室前期的研究結(jié)果表明，輪葉黨參提取物具有顯著的預(yù)防化學(xué)性肝損傷的作用[6-7]。最近的研究結(jié)果表明，輪葉黨參經(jīng)活性酵母發(fā)酵后，其抗氧化活性明顯增強[8]，但有關(guān)輪葉黨參對化學(xué)致癌物二乙基亞硝胺(DEN)的早期肝臟損傷的保護作用尚未見報道。本實驗旨在探討發(fā)酵輪葉黨參皂苷(Codonopsis lanceolata saponin，CLS)對DEN致小鼠肝臟氧化損傷的保護作用，以期能為肝癌化學(xué)預(yù)防劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

輪葉黨參采集自長白山。輪葉黨參采用活性酵母發(fā)酵，CLS的制備方法同俞星等[9]的報道。

雄性SPF級KM小鼠50只，體質(zhì)量20～22g，由延邊大學(xué)實驗動物科提供，在本研究室IVC系統(tǒng)中飼養(yǎng)并進行實驗。

DEN 日本半井化學(xué)藥品株式會社；正常熔點瓊脂糖(normal melting point agarose，NMPA)、低熔點瓊脂糖(low melting agarose，LMPA) 美國Promega公司；溴化乙啶(ethidium bromide，EB)、二甲亞砜(DMSO)、Triton X-100 美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6B型電泳儀 北京市六一儀器廠；CK-43熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；DY89-Ⅱ電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；彗星圖像分析軟件(CASP version 1.2.3b1，從http：//casplab.com獲取) 。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

雄性SPF級KM小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，然后隨機分為陰性對照組、單純DEN組(隔日腹腔注射DEN 20mg/kg)及CLS高、中、低3個劑量組(灌胃劑量200、100、50mg/(kg·d)，同時隔日腹腔注射DEN 20mg/kg)。連續(xù)6周，每天記錄各組體質(zhì)量變化情況。

1.3.2 制備肝細(xì)胞懸液

處死動物后取小鼠肝組織，用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，剪碎，加少量PBS液，在勻漿器中將組織研碎。200目銅網(wǎng)過濾，1000r/min離心10min，棄上清液。用冰冷PBS液洗滌細(xì)胞2次，用冰冷PBS液調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為105～107個/mL。

1.3.3 單細(xì)胞凝膠電泳實驗

按傳統(tǒng)方法[10]略加修改，用24孔培養(yǎng)板蓋取代載玻片，采用兩層鋪膠法。第1層膠：0.5%正常熔點瓊脂糖100μL，待凝固；第2層膠：制備好的細(xì)胞混懸液5μL和0.6%低熔點瓊脂糖45μL迅速混勻后鋪于第1層膠上面，待凝固。鋪膠后迅速移入4℃冰箱，使其凝固。在4℃條件下裂解、解旋、電泳、中和，溴化乙錠染色后盡快在熒光顯微鏡下觀察。以上步驟均避光、低溫操作，避免額外的DNA 損傷。每個樣品觀察100個細(xì)胞，顯微攝像拍照，用CASP軟件分析彗星圖像[11]。

1.3.4 肝組織中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活力含量測定

每只小鼠取200mg左右的肝組織，用冷生理鹽水沖洗、拭干、稱質(zhì)量、剪碎，置玻璃勻漿器中，加冷生理鹽水，勻漿，制成10%的組織勻漿液，4000r/min離心10min，取上清液待測。SOD、GSH-Px活性及MDA含量測定嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，體質(zhì)量變化的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，損傷分級的比較采用K-W秩和檢驗，損傷程度與藥物劑量間的相關(guān)性采用Kendall等級相關(guān)分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般體征的變化

實驗組分別腹腔注射DEN，同時灌胃不同濃度的CLS。連續(xù)觀察6周后，所有受試小鼠活動正常，均未見毛色、飲食、大小便等異常，無死亡發(fā)生。

2.2 小鼠體質(zhì)量增長的變化

圖 1 各組小鼠體質(zhì)量的變化Fig.1 Change in body weight of mice from different groups

由圖1可知，實驗第3～5周，單純DEN組小鼠體質(zhì)量增長顯著低于陰性對照(P＜0.05)，CLS高、中、低3個劑量組小鼠體質(zhì)量增長與DEN組比較，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，第6周，所有實驗組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，表明CLS在DEN引起小鼠體質(zhì)量增長受抑制過程中，未起到明顯的改善作用。

2.3 對DEN致肝細(xì)胞DNA損傷的影響

表1 輪葉黨參皂苷對DEN誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of CLS on DNA damage induced by DNE in mouse liver (±s，n=10)

表1 輪葉黨參皂苷對DEN誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of CLS on DNA damage induced by DNE in mouse liver (±s，n=10)

注：*.與陰性對照組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)；#.與DEN 組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)；Δ.與CLS 中劑量組比較，有顯著性差異(P ＜0.05)。表2 同。

組別 尾長/μm彗星長/μm尾矩Olive尾矩 尾DNA/%陰性對照組12.98±9.6098.60±27.061.82±3.513.23±4.587.81±12.61 DEN組68.02±14.10* 148.54±19.70* 23.06±16.42* 20.61±8.82* 32.91±18.76*CLS低劑量組 50.85±12.49# 140.75±29.68# 14.06±13.36#14.44±9.29#26.93±20.23#CLS中劑量組 48.59±17.63# 123.89±24.93# 11.49±10.19#12.27±7.21#26.95±20.85#CLS高劑量組 42.67±10.04# 117.87±13.64# 11.65±9.15#10.21±5.58#21.97±17.75#

由表1可知，DEN組的彗星實驗5個指標(biāo)(尾長、彗星長、尾矩、Olive尾矩及尾DNA百分率)均顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。高、中、低3個劑量組的彗星實驗5個指標(biāo)均顯著低于單純DEN組(P＜0.05)。給予CLS的3個劑量組彗星尾長、彗星長及Olive尾矩與CLS存在劑量依賴性，但尾矩和尾DNA含量與給藥劑量不呈劑量依賴關(guān)系，提示彗星實驗中用尾長、彗星長及Olive尾矩3個指標(biāo)代表DNA損傷程度比尾矩和尾DNA含量指標(biāo)更為敏感。

表2 各組DNA損傷等級比較Table 2 Comparison of DNA damage grades in different groups

由表2可知，單純DEN組DNA損傷等級與陰性對照組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，即DEN組的DNA損傷程度高于陰性對照組。給予CLS的3個組DNA損傷程度均低于DEN組，有顯著性差異(P＜0.05)，且給予CLS的各劑量組DNA損傷分級以Ⅰ級和Ⅱ級為主，單純DEN組的DNA損傷分級以Ⅲ級為主，藥物劑量與損傷程度間的相關(guān)系數(shù)τ為－0.403(P＜0.01)。

2.4 SOD、GSH-Px活性和MDA含量變化

由表3可知，DEN組肝組織勻漿中SOD、GSH-Px活性顯著低于陰性對照組(P＜0.01)；CLS高劑量組肝組織SOD活性明顯高于DEN組，CLS高、中劑量組肝組織GSH-Px活性極顯著高于DEN組(P＜0.01)；并隨著藥物濃度的增高，小鼠肝組織勻漿中GSH-Px活性也隨之增高。DEN組肝組織勻漿中MDA含量極顯著高于陰性對照組(P＜0.01)；輪葉黨參總皂苷高、中、低3個劑量組肝組織勻漿中MDA含量極顯著顯低于DEN組(P＜0.01)，并呈劑量依賴性減少。

表3 各組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較(±s，n=10)Table 3 Comparison of SOD, GSH-Px activity and MDA content in liver tissues of mice from different groups (±s，n=10)

表3 各組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性及MDA含量比較(±s，n=10)Table 3 Comparison of SOD, GSH-Px activity and MDA content in liver tissues of mice from different groups (±s，n=10)

注：**.與陰性對照組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；#.與DEN 組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。

GSH-Px活力/(U/mg pro)陰性對照組80.59±9.411.51±0.369.89±0.52 DEN組72.45±3.19** 2.44±0.35**6.72±0.52**CLS低劑量組77.12±6.471.96±0.21##7.24±0.54 CLS中劑量組76.54±3.931.86±0.37##7.58±0.64##CLS高劑量組79.89±5.71##1.48±0.27##8.85±0.82##組別SOD活力/(U/mg pro)MDA含量/(nmol/mg pro)

3 討 論

本實驗應(yīng)用改良的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的板蓋鋪膠，不易脫片，操作簡便，速度快，耗材用量少；熒光染色均勻，背景清晰無雜質(zhì)，彗星圖片質(zhì)量很高。非常適合于大量樣本的分析。

本研究結(jié)果表明在給予DEN第3～5周，小鼠體質(zhì)量增長明顯低于正常對照組，給予CLS未能改善體質(zhì)量增長，這可能是本實驗中所采用的DEN劑量在誘發(fā)肝硬變早期對小鼠毒性比較大，以至于CLS對其體質(zhì)量的影響不能起到明顯的改善作用。但從實驗結(jié)果中看到，DEN模型組和3個CLS組小鼠體質(zhì)量在實驗第6周時繼續(xù)呈上升趨勢，因此對CLS對DEN染毒小鼠體質(zhì)量增長的影響有待于今后進一步延長給藥時間，觀察期長期的效果。

DEN被公認(rèn)為自然界的強致癌物，且DEN誘發(fā)小鼠肝癌模型，其特點為誘癌成功率高，肝細(xì)胞所占比例大[12]，且其誘發(fā)的腫瘤多為肝細(xì)胞癌，與人肝細(xì)胞癌相似[13-14]。DEN誘發(fā)大鼠肝癌的過程要經(jīng)過3個階段，即肝硬變前期(1～8周)、肝硬變期(8～14周)、癌變期(14～20周)[15]。本實驗結(jié)果表明，小鼠給予DEN 20mg/kg連續(xù)6周，肝組織抗氧化酶活性顯著下降，過氧化物堆積，肝細(xì)胞DNA出現(xiàn)明顯的損傷，表明以小鼠作為實驗?zāi)Ｐ停?周時出現(xiàn)肝臟損傷的變化。

DEN在肝細(xì)胞內(nèi)通過細(xì)胞色素CYP2E1亞型代謝而形成活性氧(ROS)，后者對機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[16]，ROS與有些細(xì)胞成分(包括脂質(zhì)、蛋白、DNA、碳水化合物、硫醇及其他低分子質(zhì)量抗氧化劑)結(jié)合，引起大分子氧化，最終導(dǎo)致病理改變[17]，進入肝癌的啟動階段。在DEN誘發(fā)肝癌的早期，如果降低體內(nèi)過多的自由基水平，可以抑制或消除肝癌的啟動及發(fā)展。體內(nèi)氧自由基的增加可以引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，進而引起細(xì)胞核中的DNA受損。MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，能反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果表明，單純給予DEN的小鼠肝細(xì)胞DNA嚴(yán)重受損，而同時給予CLS的各個劑量組DNA損傷程度明顯減輕，且呈劑量依賴性，表明在化學(xué)致癌物作用于機體的早期使用CLS，可以有效控制致癌物的肝癌啟動階段，進而達到預(yù)防肝癌的目的。本研究結(jié)果表明，DEN誘發(fā)小鼠肝癌的早期肝組織MDA水平顯著提高，給予CLS的各個劑量組MDA水平明顯低于單純DEN組，表明CLS在體內(nèi)通過清除DEN代謝過程中產(chǎn)生的過多的自由基，保護肝細(xì)胞DNA受損。

SOD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)、具有清除氧自由基的功效，能夠平衡機體的氧自由基，避免體內(nèi)超氧陰離子自由基的過度積累。GSH-Px是一種廣泛存在于體內(nèi)的過氧化物分解酶，能清除體內(nèi)過多的脂質(zhì)過氧化物，因此，SOD和GSH-Px在體內(nèi)協(xié)同作用，防止脂質(zhì)過氧化及其代謝產(chǎn)物對機體的損害。本研究結(jié)果表明，給予小鼠腹腔注射DEN的同時給予CLS，高劑量組的SOD和中、高劑量組的GSH-Px活性顯著的提高，表明CLS保護SOD和GSH-Px兩大抗氧化酶，清除由DEN代謝過程中產(chǎn)生的過多的自由基和過氧化物，從而保護了細(xì)胞膜的完整性，阻止DNA的損傷。

劉婷婷等[8]證明發(fā)酵輪葉黨參乙醇提取物在體外具有很強的清除DPPH自由基能力，其作用強于未發(fā)酵輪葉黨參， Kim等[3]證明輪葉黨參乙醇提取物和正丁醇提取物在體外實驗中具有很強的還原能力、清除DPPH自由基能力，并認(rèn)為輪葉黨參提取物是直接抗氧化劑。因此，推測CLS對DEN誘發(fā)小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的保護作用除了通過保護SOD、GSH-Px酶活性而清除自由基和過氧化物的途徑外，還可能是通過CLS自身的直接抗氧化和清除自由基作用來實現(xiàn)的。

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