熱處理對(duì)牛乳鐵蛋白促成骨細(xì)胞增殖活性影響

劉 猛，杜 明*，孔瑩瑩，徐偉麗，宋 微，張?zhí)m威

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090)

乳鐵蛋白(Lf)又稱(chēng)乳鐵傳遞蛋白，主要存在于哺乳動(dòng)物的各種外分泌物中，如乳汁、淚液或唾液等[1]。Lf可以作為一種鐵強(qiáng)化劑調(diào)控鐵的生物利用率，此外，Lf還具有多種其他生物功能，例如抗菌、抗病毒和抗氧化作用，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力[2]等。近期，乳鐵蛋白被發(fā)現(xiàn)具有促骨生長(zhǎng)的功效[3-4]。諸多研究表明，Lf既能刺激成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化、也能抑制破骨細(xì)胞生長(zhǎng)與活性、誘導(dǎo)破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)凋亡[5-6]。體內(nèi)研究表明，乳鐵蛋白在骨生長(zhǎng)和代謝中起到一定的生理作用，能促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)[7]。在乳品加工業(yè)中，熱處理是最為常見(jiàn)的操作單元，然而迄今為止，熱處理對(duì)乳鐵蛋白活性的影響研究主要集中在抗菌活性等方面。熱處理對(duì)乳鐵蛋白成骨作用的影響報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)主要研究熱處理(溫度和時(shí)間)對(duì)乳鐵蛋白成骨活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SD大鼠乳鼠(72h以?xún)?nèi))由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。

乳鐵蛋白(＞94%)、Ⅱ型膠原酶、MTT 美國(guó)Sigma公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶-EDTA消化液 Solarbio公司；二甲基亞砜(DMSO)、巴比妥鈉 美國(guó)Gibco公司。

倒置式生物顯微鏡 日本Nikon公司；Eon型酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；HEPA class 100型細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞分離鑒定

從新生SD大鼠乳鼠中提取成骨細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)觀察、HE 染色、堿性磷酸酶染色及礦化結(jié)節(jié)染色來(lái)鑒定成骨細(xì)胞[8]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及熱處理

樣品分組：Lf低質(zhì)量濃度組(50μg/mL)、中質(zhì)量濃度組(100μg/mL)、高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)。熱處理?xiàng)l件：62～65℃處理 30min、72℃處理 10s、85℃處理10min以及95℃處理10min。以未經(jīng)加熱的乳鐵蛋白(Native-Lf)為對(duì)照。

1.2.3 MTT法測(cè)定成骨細(xì)胞增殖

調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)量濃度為每孔l×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，每孔再加入95μL培養(yǎng)液以及5μL樣品溶液。測(cè)定前4h，加10μL 0.5mg/mL MTT(pH7.2 0.01mol/L PBS配制)，培養(yǎng)箱中孵育4h。棄去培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO，振蕩10min使結(jié)晶溶解。波長(zhǎng)490nm 處測(cè)定OD490nm[9]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖

數(shù)據(jù)采用 Origin8.0軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，One-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 成骨細(xì)胞的鑒定

圖 1 SD大鼠乳鼠成骨細(xì)胞分離與鑒定Fig.1 Isolation and identifi cation of osteoblasts from newborn SD rats

倒置顯微鏡觀察成骨細(xì)胞，以不規(guī)則形、長(zhǎng)梭形、三角形為主，相鄰細(xì)胞彼此貼靠，邊界難以分清，結(jié)果如圖1a所示，HE染色、堿性磷酸酶染色、礦化結(jié)節(jié)染色分別如圖1b～d所示，這些染色結(jié)果均表明分離的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的所有特征[8]。

2.2 Native-Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

圖 2 未經(jīng)過(guò)熱處理的Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用Fig.2 Osteoblast-promoting activity of lactoferrin without heat treatment

Native-Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用影響如圖2所示，Native-Lf低質(zhì)量濃度組(50μg/mL)在24、48、72h對(duì)成骨細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用；中質(zhì)量濃度組(100μg/mL)作用細(xì)胞24h能顯著性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，48h和72h能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖；高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)在24h和48h能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，在72h時(shí)顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Native-Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系，這與文獻(xiàn)[5,10]報(bào)道具有一致性。但24～72h不同時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出的趨勢(shì)略有不同，24h條件下，高質(zhì)量濃度 Native-Lf活性最高，與中質(zhì)量濃度和低質(zhì)量濃度組差異顯著；48h中質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度組Native-Lf活性顯著高于低質(zhì)量濃度組；72h條件下，中質(zhì)量濃度的活性顯著高于低質(zhì)量濃度組和高質(zhì)量濃度組。整體上看，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Native-Lf的最佳作用質(zhì)量濃度有一定的下降趨勢(shì)。

2.3 不同溫度熱處理對(duì)乳鐵蛋白成骨細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 65℃加熱處理Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用影響

Lf經(jīng)過(guò)65℃加熱處理30min，對(duì)成骨細(xì)胞作用結(jié)果如圖3所示。24h，質(zhì)量濃度在50～500μg/mL時(shí)能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；48h和72h，低質(zhì)量濃度組可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，在Lf為100μg/mL時(shí)能極顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。高質(zhì)量濃度組在48h和72h相對(duì)于對(duì)照組，有少量增加，但差異不顯著。這些結(jié)果說(shuō)明65℃/30min對(duì)Lf的活性影響在50～100μg/mL范圍內(nèi)幾乎無(wú)顯著影響，對(duì)于高質(zhì)量濃度組有一定的影響。研究表明，這4種加熱參數(shù)對(duì)于乳鐵蛋白熱聚集的誘導(dǎo)作用是不同的，隨著加熱強(qiáng)度的提高，乳鐵蛋白的熱聚集作用增強(qiáng)。高質(zhì)量濃度時(shí)，Lf熱聚集的趨勢(shì)相應(yīng)增強(qiáng)，相應(yīng)地Lf的生理活性受影響也較為明顯。

圖 3 65℃/30min處理的Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of 65 ℃/30 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.2 72℃加熱處理Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用影響

圖 4 72 ℃/10s處理LF對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of 72 ℃/10 s on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf經(jīng)72℃加熱處理10s，對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用結(jié)果如圖4所示。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)條件下，各質(zhì)量濃度組均可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而且低質(zhì)量濃度組(50μg/mL)顯著高于中質(zhì)量濃度組(100μg/mL)和高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)。整體趨勢(shì)與未經(jīng)加熱處理的Lf相差不大，這說(shuō)明72℃/10s對(duì)Lf的活性影響相對(duì)較小，尤其對(duì)于質(zhì)量濃度較低的情況影響較小。

2.3.3 85℃加熱處理Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用影響

Lf經(jīng)85℃加熱處理10min，對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用如圖 5所示。24h時(shí)，低質(zhì)量濃度組可極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，中質(zhì)量濃度組與對(duì)照組差異顯著，高質(zhì)量濃度組則極顯著抑制細(xì)胞增殖；48h時(shí)，Lf在中低質(zhì)量濃度時(shí)與對(duì)照組差異不顯著，在高質(zhì)量濃度時(shí)則極顯著抑制成骨細(xì)胞增殖；72h，低質(zhì)量濃度組可極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，中質(zhì)量濃度組時(shí)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，高質(zhì)量濃度組則顯著性抑制成骨細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，85℃/10min對(duì)Lf活性影響較大，整體上呈下降趨勢(shì)，在高質(zhì)量濃度組影響較大。而且在不同時(shí)間點(diǎn)，活性表現(xiàn)不同，分析可能是由于Lf對(duì)調(diào)控成骨細(xì)胞增殖的信號(hào)通路調(diào)控作用不同造成的[11-12]。

成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)分化主要由以絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)。主要包括ERK、JNK 和p38MAPK 3個(gè)亞通路。有研究報(bào)導(dǎo)了Lf調(diào)控成骨細(xì)胞p42/44MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖，并明顯地抑制成骨細(xì)胞凋亡[12]。因此，有本研究結(jié)果推測(cè)，Lf對(duì)這些信號(hào)通路的調(diào)控可能發(fā)生在不同的階段，由此造成了上述現(xiàn)象。

圖 5 85℃/10min處理Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of 85 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

2.3.4 95℃加熱處理Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用影響

圖 6 95℃/10min處理Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of 95 ℃/10 min on the osteoblast-promoting activity of lactoferrin

Lf經(jīng)95℃加熱處理10min，對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用如圖6所示。24h時(shí)，低、中質(zhì)量濃度組的Lf可顯著性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，高質(zhì)量濃度組(500μg/mL)則極顯著性抑制成骨細(xì)胞增殖；48h與72h時(shí)，中低質(zhì)量濃度組與對(duì)照組無(wú)顯著差異，高質(zhì)量濃度組顯著性抑制成骨細(xì)胞增殖；這說(shuō)明95℃加熱處理10min對(duì)乳鐵蛋白的活性具有明顯影響，趨勢(shì)與85℃/10min處理組相似。

Rüegg等[13]研究發(fā)現(xiàn)在pH值為6.6時(shí)，Lf在65～69℃時(shí)開(kāi)始失活。研究發(fā)現(xiàn)Lf的Tm隨pH值減小而降低，當(dāng)體系pH值由7.0降至3.0時(shí)，牛乳乳鐵蛋白(bLf)的Tm由70℃變化為39℃，且bLf的變性是不可逆的。程金波等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同的溫度與時(shí)間的熱處理方式組合可以顯著的影響乳中Lf的活性。有研究表明，巴氏殺菌對(duì)bLf結(jié)構(gòu)及抗菌活性基本上沒(méi)影響[15]。另外，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能。Lf發(fā)揮功能過(guò)程中可能以骨橋蛋白(OPN)作為運(yùn)轉(zhuǎn)載體[16-17]，并主要通過(guò)LRP1/2介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入成骨細(xì)胞[18]，這些蛋白間的相互作用也隨著Lf結(jié)構(gòu)的變化而變化。本小組此前的研究報(bào)道了Native-Lf的變性溫度為73.1℃，當(dāng)處理溫度大于73.1℃時(shí)，Lf發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，與OPN和LRP1等的相互作用也將發(fā)生改變，活性也將受到影響。因此本研究中65℃/30min和72℃/10s對(duì)Lf活性影響較小，85℃/10min和95℃/10min對(duì)Lf活性的影響較大，這些熱處理對(duì)Lf促成骨活性的影響程度從小到大的順序?yàn)?2℃/10s＜65℃/30min＜85℃/10min＜ 95℃/10min。

3 結(jié) 論

未經(jīng)加熱處理的乳鐵蛋白具有良好的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖活性，在50～500μg/mL可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。一定強(qiáng)度的熱處理將破壞乳鐵蛋白的促成骨活性，隨著熱處理強(qiáng)度的提高，該活性損失程度逐漸增加。65℃/30min和72℃ 10s對(duì)Lf的活性無(wú)顯著影響，85℃/10min和95℃/10min對(duì)Lf成骨活性影響顯著，尤其是對(duì)高質(zhì)量濃度的劑量組。不同時(shí)間點(diǎn)，Lf對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響表現(xiàn)不同。

[1] BAKER E N, BAKER H M. A structural framework for understanding the multifunctional character of lactoferrin[J]. Biochimie, 2009, 91(1): 3-10.

[2] FARNAUD S, EVANS R W. Lactoferrin: a multifunctional protein with antimicrobial properties[J]. Mol Immunol, 2003, 40(7): 395-405.

[3] NAOT D, GREY A, REID I R, et al. Lactoferrin: a novel bone growth factor[J]. Clin Med Res, 2005: 3(2): 93-101.

[4] CORNISH J, PALMANO K, CALLON K E, et al. Lactoferrin and bone; structure activity relationships[J]. Biochem Cell Biol, 2006, 84(3): 297-302.

[5] CORNISH J, CALLON K E, NAOT D, et al. Lactoferrin is a potent regulator of bone cell activity and increases bone formation in vivo[J]. Endocrinology, 2004, 145(9): 4366-4374.

[6] KRUGER M C, POULSEN R C, SCHOLLUM L, et al. A comparison between acidic and basic protein fractions from whey or milk for reduction of bone loss in the ovariectomized rat[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(10): 1149-1156.

[7] 肖暉, 劉寧. 牛源乳鐵蛋白對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞 RANKL 和OPG mRNA 表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志, 2008,14(7): 463-466.

[8] 曹陽(yáng)陽(yáng), 張楠楠, 李丹丹, 等. 鐵飽和乳鐵蛋白對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響[J]. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志, 2009, 15(10): 752-755.

[9] 王洪復(fù). 骨細(xì)胞圖譜與骨細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2001.

[10] 肖暉, 劉寧. 乳鐵蛋白對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響[J]. 國(guó)際骨科學(xué)雜志, 2008, 29(3): 198-201.

[11] MAGDALENA C, MARLENA C K. Osteoprotegerin-receptor activator of nuclear factor-κB ligand ratio: a new approach to osteoporosis treatment[J]. Southern Medical Journal, 2004, 97(5): 506-511.

[12] 孔瑩瑩, 杜明, 劉猛, 等. 乳鐵蛋白理化性質(zhì)及其成骨作用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(21): 318-322.

[13] RUEGG M. A calorimetric study of the thermal denaturation of whey proteins in simulated milk ultrafi ltrate[J]. Journal of Dairy Research, 1977, 82(3): 1082-1085.

[14] 程金波, 王加啟, 李珊珊, 等. 不同熱處理方式對(duì)牛奶中IgG和乳鐵蛋白的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2010, 25(增刊1): 170-174.

[15] SREEDHARA A, FLENGSRUD R, PRAKASH V, et al. A comparison of effects of pH on the thermal stability and conformation of caprine and bovine lactoferrin[J]. International Dairy Journal, 2010, 20(7): 487-494.

[16] AZUMA N, MAETA A, FUKUCHI K, et al. A rapid method for purifying osteopontin from bovine milk and interaction between osteopontin and other milk proteins[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(4): 370-378.

[17] DU Ming, XU Weili, YI Huaxi, et al. Protective effects of bovine colostrum acid proteins on bone loss of ovariectomized rats and the ingredients identification [J]. Mol Nutr Food Res, 2011, 55(2): 220-228.

[18] GREY A, ZHU Q, WATSON M, et al. Lactoferrin potently inhibits osteoblast apoptosis, via an LRP1-independent pathway[J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2006, 251(1): 96-102.