血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)在糖尿病大鼠腎損傷中的作用及機制分析

王珊珊，馬 暢，張 偉，王艷霞，張源淑*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotensin system，RAS)是心血管和腎臟功能調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，通過其經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme Ⅰ，ACE)-血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)-血管緊張素Ⅱ受體1亞型(Ang Ⅱ type 1 receptor，AT1)通路在調(diào)節(jié)水鹽代謝、維持血容量與血管張力以及調(diào)控心臟、腎臟功能等方面功效顯著。2 0 0 0 年血管緊張素轉(zhuǎn)化 酶2(angiotensin converting enzyme Ⅱ，ACE2)的發(fā)現(xiàn)[1]，極大地豐富了經(jīng)典RAS。ACE2與ACE是一對相互拮抗、生理功能相反的酶[2]。其主要生物學(xué)效應(yīng)是水解Ang Ⅱ生成具有舒張血管、拮抗細(xì)胞增殖和抗炎癥作用的血管緊張素1-7(angiotensin 1-7，Ang 1-7)[3]?，F(xiàn)已證明RAS存在著兩條在生理作用上相互拮抗的通路：一條為ACEAngⅡ-AT1通路，能引起血管收縮，血壓升高；另一條為ACE2-Ang-(1-7)-Mas通路，通過抗衡前一條通路引起血管舒張血壓下降等生理作用[4]。兩條通路失衡將導(dǎo)致糖尿病、心功能紊亂、高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。

近年研究發(fā)現(xiàn)除經(jīng)典RAS(循環(huán)RAS)外，局部組織如腎臟、心臟、血管壁、腦等組織還具有獨立的RAS，主要對局部組織的生長分化和病理生理進行調(diào)節(jié)[6]。腎臟中存在高水平的RAS中各種成分，如：腎素、Ang Ⅰ、Ang Ⅱ、ACE、ACE2等。腎臟局部RAS的過度激活是導(dǎo)致糖尿病、糖尿病腎病等多種腎臟疾病的主要原因[7]。

本實驗室已有的研究提示ACE2在糖尿病腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用并具有一定的抗損傷和保護腎臟的作用[8-9]，但在糖尿病引起的腎損傷過程中ACE2是如何抗衡ACE水解產(chǎn)生Ang Ⅱ及Mas和AT1受體的表達(dá)水平的變化還有待研究。因此，本實驗通過鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)致大鼠不同程度腎損傷，擬通過觀察ACE2、ACE和其相應(yīng)下游受體mRNA表達(dá)的變化，并結(jié)合腎臟局部組織中其上游腎素活性和AngⅠ及下游AngⅡ含量變化，進一步探討ACE2及其通路在腎損傷中的作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

PCR引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

STZ 美國Sigma公司；TRNzol試劑盒 南京天為生物科技有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA抑制劑、隨機引物 南京生興生物技術(shù)有限公司；腎素、AngⅠ和AngⅡ放射免疫試劑盒(靈敏度：10pg/mL，精密度：批內(nèi)變異系數(shù)：＜10%，批間變異系數(shù)：＜15%) 北京北方生物技術(shù)研究所。

PT1200CL手持式電動勻漿機 瑞士Polytron公司；GMBh8 CO.KG Miklro-22R高速低溫離心機 德國Andreas Hettich公司；BS210S電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；核酸濃度測量儀 德國Eppndorf 公司；Q5PCR儀 美國Bio-Rad公司；FMQ-9013C放射免疫γ計數(shù)器 上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠。

1.2 實驗動物

S D 雄性大鼠，體質(zhì)量2 0 0 ～2 2 0 g(東南大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證(號碼：SYXK(蘇)2001-0017)和實驗動物生產(chǎn)許可證(號碼：SCXK(蘇)2001-0005)。實驗鼠用顆粒飼料 江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 STZ致不同程度大鼠糖尿病腎損傷模型的建立

參照沈亞非等[10]的方法。健康成年SD大鼠40只，1周適應(yīng)期后，隨機取16只作為正常對照組，其余大鼠按60mg/kg(以體質(zhì)量計)劑量一次性腹腔內(nèi)注射STZ(0.1mmol/L，pH4.2檸檬酸緩沖液溶解，新鮮配制)，正常對照組按0.1mL/kg(以體質(zhì)量計)劑量腹腔注射檸檬酸緩沖液。分別于注射后24、72h后，剪尾法采集血樣，用血糖儀測定所有實驗大鼠的空腹(禁食8h)血糖水平。以空腹條件下2次血糖值≥11.1mmol/L為糖尿病造模成功大鼠[11-13]。

1.3.2 實驗分組與樣品采集

給藥后大鼠自由采食與飲水，于15d隨機選取8只模型大鼠(模型1組)和8只正常對照大鼠(對照1組)，禁食12h后斷頭處死并靜脈采血，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆茫蝗∽竽I，液氮速凍后轉(zhuǎn)到－80℃冰箱保存；其余16 只(模型2組和對照2組各8只)大鼠繼續(xù)觀察15d后，斷頭處死，同上取樣并處理。

1.3.3 ACE、ACE2、AT1、Mas在糖尿病大鼠腎臟中mRNA水平分析

1.3.3.1 腎臟組織中總RNA的提取

取約100mg的腎組織，采用TRIzol一步抽提法提取腎臟組織的總RNA。紫外比色法(OD260nm和OD280nm)測定總RNA 的濃度和純度。

1.3.3.2 反轉(zhuǎn)錄

各樣品取RNA 2μg，在25μL體系進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3 目的基因引物設(shè)計

目的基因和β-actin內(nèi)標(biāo)引物序列是根據(jù)GenBank上序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計，由上海英俊技術(shù)有限公司合成，引物序列及參數(shù)見表1。

表1 ACE2, ACE, AT1, Mas和β-actin引物參數(shù)Table 1 Parameters of primer pairs for ACE2, ACE, AT1, Mas and β-actin genes

以β-actin作為內(nèi)參，對ACE2、ACE、AT1、Mas基因進行實時熒光定量分析。實時熒光定量PCR采用SYBR Green染料，三步法檢測目的基因的相對表達(dá)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性20s，58～62℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)，利用相對定量ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

1.3.4 腎臟組織中腎素活性和AngⅠ、Ang Ⅱ含量測定

放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)測定腎臟組織中腎素活性和AngⅠ、AngⅡ含量。具體操作均按試劑盒說明書進行。

式中：c測定管為測定管腎素含量/(ng/g)；c對照管為對照管腎素含量/(ng/g)；t溫浴為溫浴時間/h。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE2、ACE、AT1和Mas在糖尿病大鼠腎臟組織中mRNA水平分析

2.1.1 ACE2、Mas在糖尿病大鼠腎臟組織中mRNA水平分析

圖 1 ACE2、Mas在對照組和模型組大鼠腎臟中mRNA水平變化(n=8)Fig.1 Comparison of the renal exression levels of ACE2 and Mas mRNA between the control groups and the model groups (n=8)

由圖1可知，與對照組相比，模型1組大鼠腎臟組織中ACE2和其Mas受體mRNA表達(dá)升高(對照組ACE2：1.63±0.30，模型組ACE2：1.81±0.74，P=0.07)和(對照組Mas：1.30±0.15，模型組Mas：1.51±0.19，P=0.085)，但無顯著性差異。模型2組大鼠腎臟組織中ACE2 mRNA表達(dá)顯著低于對照組(對照組：1.25±0.24，模型組： 0.32±0.01，P=0.032)，Mas受體mRNA表達(dá)無顯著變化(對照組：1.24±0.30，模型組：1.49±0.08，P=0.083)。

2.1.2 ACE、AT1在糖尿病大鼠腎臟組織中mRNA水平分析

圖 2 ACE、AT1在對照組和模型組大鼠腎臟中mRNA水平變化(n=8)Fig.2 Comparison of the renal expression levels of ACE and AT1 mRNA between the control groups and the model groups (n=8)

由圖2可知，與對照1組相比，模型1組大鼠腎臟ACE mRNA表達(dá)升高，無顯著性差異(模型組：1.17±0.42，對照組：1.20±0.21，P=0.92)，AT1 mRNA表達(dá)下降 (對照組：1.05±0.13，模型組：0.76±0.05，P=0.15)；模型2組大鼠腎臟組織中ACE mRNA的表達(dá)升高，差異顯著 (對照組：1.09±0.19，模型組：1.52±0.07，P=0.008)，AT1受體有同樣升高趨勢，無顯著性差異(對照組：1.15±0.25，模型組：1.29±0.31，P=0.12)。

2.2 ACE mRNA/ACE2 mRNA比值分析

由表2可知，與對照組相比，模型1組大鼠腎臟組織中ACE mRNA/ACE2 mRNA降低，而模型2組中兩者的比值與對照2組相比極顯著升高(P＜0.01)，提示在糖尿病腎損傷15d(模型1組)時ACE2的表達(dá)占優(yōu)勢，而在30d(模型2組)時ACE mRNA表達(dá)占優(yōu)勢。

表2 對照組和模型組大鼠腎臟ACE/ACE2 mRNA的比較(n=8)Table 2 Comparison of ACE/ACE2 mRNA expression ratio between the control groups and the model groups (n=8)

2.3 腎臟組織中腎素活性和AngⅠ、AngⅡ含量測定結(jié)果分析

表3 對照組和模型組大鼠腎臟中腎素活性和AngⅠ、Ang Ⅱ含量比較(n=8)Table 3 Comparison of renin activity and the contents of AngⅠ and AngⅡ between the control groups and the model groups (n=8)

由表3可知，與對照組相比，模型1組腎臟組織中腎素活性極顯著降低(P=0.0034)，AngⅠ含量也降低(P=0.036)，而AngⅡ含量稍有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.35)；模型2組腎臟組織腎素活性極顯著高于對照2組腎素活性(P=0.0058)，模型2組AngⅠ和AngⅡ含量高于對照2組兩者的含量，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0025和P=0.03)。

3 討 論

腎臟是產(chǎn)生RAS各組分的關(guān)鍵器官之一。ACE是RAS的核心酶，其酶解產(chǎn)物AngⅡ是RAS中最重要的效應(yīng)因子。已有的研究認(rèn)為AngⅡ?qū)δI臟的生理及病理過程的調(diào)節(jié)具有重要作用[14]。過量的AngⅡ可使腎小球系膜細(xì)胞收縮改變?yōu)V過面積，刺激系膜細(xì)胞增殖，長期發(fā)展將導(dǎo)致腎小球損傷和腎功能喪失[15]。Crackower等[4]研究發(fā)現(xiàn)ACE2基因敲除小鼠表現(xiàn)為血壓正常，血漿和局部組織中AngⅡ升高和嚴(yán)重的組織功能受損(如腎臟和心臟)；但ACE和ACE2雙重敲除的小鼠則不會出現(xiàn)此種狀況，表現(xiàn)為血漿和局部組織AngⅡ水平正常，據(jù)此推測組織功能受損可能是由于高水平的AngⅡ引起的。本研究對STZ所致糖尿病腎損傷大鼠研究發(fā)現(xiàn)，在STZ所致的不同時期(15d和30d)的糖尿病腎損傷模型大鼠的腎臟局部組織中AngⅡ含量均升高，在糖尿病腎損傷15d時(模型1組)AngⅡ升高4.7%，而在糖尿病腎損傷30d(模型2組)時則升高28.7%，提示腎臟局部組織中高水平的Ang Ⅱ可能加重腎臟組織的損傷。

ACE2是新近發(fā)現(xiàn)的ACE的同系物但與ACE功能相反，在RAS中ACE2-Ang-(1-7)軸和ACE- Ang Ⅱ軸之間存在著平衡狀態(tài)，ACE2-Ang-(1-7)軸在RAS中起對抗ACEAng Ⅱ軸的作用，ACE2/ACE之間的相對平衡決定著AngⅡ的生成量[7,14,16]。本研究對糖尿病腎損傷大鼠研究發(fā)現(xiàn)，不同時期糖尿病腎損傷大鼠腎臟中ACE2 和ACE mRNA水平有很大差異。與對照組相比，15d時(模型1組)ACE和ACE2的mRNA表達(dá)均升高，ACE/ACE2 mRNA比值降低；而在30d(模型2組)時ACE2 mRNA顯著降低，ACE mRNA表達(dá)升高從而導(dǎo)致兩者比值升高且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在機體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境系統(tǒng)中，影響和調(diào)節(jié)ACE/ACE2基因和蛋白表達(dá)的因素非常多，推測這是機體的一種代償機制，在糖尿病腎臟損傷發(fā)生發(fā)展過程中，ACE/ACE2均被激活，損傷初期ACE/ACE2在一個較低水平達(dá)到平衡，控制過量AngⅡ生成，暫時減緩病程的發(fā)展；而在中后期時ACE/ACE2在一個較高水平上相互對抗，引發(fā)RAS失衡，使AngⅡ累積，最終加劇腎組織損傷。

Danser[17]在動物實驗上證實，腎素可以通過其受體直接發(fā)揮血管緊張素的作用，腎素受體的過度表達(dá)可以使血壓升高，血漿醛固酮升高，腎皮質(zhì)的環(huán)氧化酶-2的表達(dá)增加。Brown等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可激活腎臟局部RAS使腎素活性明顯增強，使得AngⅠ和AngⅡ含量增加。本研究表明，在糖尿病腎損傷30d(模型2組)大鼠腎臟組織中的腎素活性和AngⅠ含量均顯著升高，與AngⅡ水平變化趨勢相同，與Brown等[18]的結(jié)果一致，而糖尿病腎損傷15d(模型1組)結(jié)果正好相反，大鼠腎臟組織中的腎素活性和AngⅠ含量降低。提示在糖尿病早期腎素活性下調(diào)，AngⅠ含量降低可能是RAS保護組織受損的一種機制。

本實驗中也對腎臟組織中Ang-(1-7)的受體Mas、AngⅡ的受體AT1的mRNA表達(dá)進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎損傷15d(模型1組)大鼠腎臟組織中的Mas受體mRNA表達(dá)有升高趨勢；30d(模型2組)大鼠腎組織中的AT1受體mRNA表達(dá)升高，因此，認(rèn)為ACE-AT1軸和ACE2-Mas軸異常是引發(fā)糖尿病腎損傷的一個重要原因，其機理一方面可能是ACE-AngⅡ-AT1通路的過度激活加速了AngⅡ的生成；另一方面ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸相對不足又減少了AngⅡ的降解和Ang(1-7)的生成，而過多的AngⅡ反饋抑制了ACE2的表達(dá)引起組織損傷。

綜上所述，STZ致不同程度糖尿病腎臟局部RAS的激活程度不同，糖尿病初期以ACE2軸占主導(dǎo)，ACE2激活程度強于ACE，ACE2抗衡ACE的作用，控制過量AngⅡ的生成，對腎臟組織的損傷具有保護作用；糖尿病中末期ACE軸占優(yōu)勢，ACE激活程度強于ACE2，表現(xiàn)為腎臟局部組織中腎素活性增強，AngⅠ、AngⅡ含量顯著升高，腎臟組織損傷加劇；ACE2在糖尿病腎損傷早期具有抗損傷作用，其抗損傷機理不完全是通過Mas受體介導(dǎo)，詳細(xì)機制有待進一步的研究。

[1] DONOGHUE M, HSIEH F, BARONAS E, et al. A novel angiotensinconverting enzyme–related carboxypeptidase (ACE2) converts angiotensin Ⅰ to angiotensin 1-9[J]. Circulation Research, 2000, 87(5): e1-e9.

[2] CANALS M, JENKINS L, KELLETT E, et al. Up-regulation of the angiotensin II type 1 receptor by the MAS proto-oncogene is due to constitutive activation of Gq/G11 by MAS[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(24): 16757-16767.

[3] HIGUCHI S, OHTSU H, SUZUKI H, et al. Angiotensin II signal transduction through the AT1 receptor: novel insights into mechanisms and pathophysiology[J]. Clinical Science, 2007, 112: 417-428.

[4] CRACKOWER M A, SARAO R, OUDIT G Y, et al. Angiotensinconverting enzyme 2 is an essential regulator of heart function[J]. Nature, 2002, 417: 822-828.

[5] YAGIL Y, YAGIL C. Hypothesis ACE2 modulates blood pressure in the mammalian organism[J]. Hypertension, 2003, 41(4): 871-873.

[6] MIZUIRI S, HEMMI H, ARITA M, et al. Expression of ACE and ACE2 in individuals with diabetic kidney disease and healthy controls[J]. American Journal of Kidney Diseases, 2008, 51(4): 613-623.

[7] SANTOS R A, FERREIRA A J, SIM?ES E SILVA A C. Recent advances in the angiotensin-converting enzyme 2-angiotensin (1-7)-Mas axis[J]. Experimental Physiology, 2008, 93(5): 519-527.

[8] 李鵬飛, 鄭君希, 張偉, 等. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 Ⅱ 在中毒大鼠肝臟中的作用與機制分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2010, 41(3): 353-359.

[9] 王艷霞, 張偉, 韓東寧, 等. 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2 (ACE2) 對大鼠腎氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其機制[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2011, 19(5): 881-886.

[10] 沈亞非, 徐焱成. 鏈脲佐菌素誘導(dǎo)實驗性糖尿病大鼠模型建立的研究[J]. 實用診斷與治療雜志, 2005, 19(2): 79-80.

[11] SHARMA K, JIN Y, GUO J, et al. Neutralization of TGF-β by anti-TGF-β antibody attenuates kidney hypertrophy and the enhanced extracellular matrix gene expression in STZ-induced diabetic mice[J]. Diabetes, 1996, 45(4): 522-530.

[12] YE M, WYSOCKI J, WILLIAM J, et al. Glomerular localization and expression of angiotensin-converting enzyme 2 and angiotensinconverting enzyme: implications for albuminuria in diabetes[J]. Journal of the American Society of Nephrology, 2006, 17(11): 3067-3075.

[13] ZHANG W, MIAO J, MA C, et al. β-Casomorphin-7 attenuates the development of nephropathy in typeⅠdiabetes via inhibition of epithelial-mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells[J]. Peptides, 2012, 36(2): 186-191.

[14] INGELFINGER J R. ACE2: a new target for prevention of diabetic nephropathy?[J]. Journal of the American Society of Nephrology, 2006, 17(11): 2957-2959.

[15] MITSUHASHI T, NAKAYAMA H, ITOH T, et al. Immunochemical detection of advanced glycation end products in renal cortex from STZ-induced diabetic rat[J]. Diabetes, 1993, 42(6): 826-832.

[16] TIPNIS S R, HOOPER N M, HYDE R, et al. A human homolog of angiotensin-converting enzyme cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(43): 33238-33243.

[17] DANSER A H. Novel drugs targeting hypertension: renin inhibitors[J]. Journal of Cardiovascular Pharmacology, 2007, 50(2): 105-111.

[18] BROWN L, WALL D, MARCHANT C, et al. Tissue-specific changes in angiotensin Ⅱ receptors in streptozotocin-diabetic rats[J]. Journal of Endocrinology,1997, 154(2): 355-362.