大腸桿菌重組表達(dá)磷脂酶C的發(fā)酵工藝優(yōu)化

趙金星，張 梁，顧正華，丁重陽(yáng)，石貴陽(yáng)

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

磷脂酶C(PLC，EC3.1.4.3) 廣泛存在于微生物和動(dòng)植物的組織和細(xì)胞中，到目前為止已發(fā)現(xiàn)20多種不同的PLC分子結(jié)構(gòu)。PLC可水解甘油磷脂C3位點(diǎn)甘油磷酸脂鍵，生成甘油二酯(DAG)和磷酸單酯[1]，磷脂酶C的活性需要Zn2+、Mg2+等金屬離子激活。

PLC在抗血小板新藥研究[2-4]、高血壓[5]等病理研究以及食品工業(yè)添加劑、油脂精煉等方面都有應(yīng)用。但是從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度來(lái)看，磷脂酶C應(yīng)用于油脂酶法脫膠最具工業(yè)應(yīng)用前景。從目前的研究結(jié)果來(lái)看，酶法脫膠的效果較好，但使用的酶主要是Novoeymes公司推出的2款磷脂酶-Lecitse Novo和Lecitase Ultra，對(duì)于大宗油脫膠來(lái)說(shuō)，成本較高。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)商業(yè)化磷脂酶，國(guó)內(nèi)的工業(yè)用磷脂酶主要依賴進(jìn)口，國(guó)外能夠引進(jìn)工業(yè)應(yīng)用的磷脂酶只有諾維信A/S鏈霉菌屬來(lái)源磷脂酶和鐮刀菌屬磷脂酶來(lái)源磷脂酶A。雖然有研究表明利用磷脂酶C進(jìn)行油脂精煉可以將油耗降低3.6%，但是由于磷脂酶C產(chǎn)量較低，工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值還不能很好的體現(xiàn)。

鑒于磷脂酶C在醫(yī)藥、食品等工業(yè)特別是油脂脫膠領(lǐng)域的應(yīng)用前景，相關(guān)研究正愈發(fā)受到重視。由于野生微生物菌株磷脂酶產(chǎn)量較低，并且已知的大多數(shù)微生物來(lái)源磷脂酶C都以毒素因子的形式存在于致病性的病原體中，異源表達(dá)雖得到了一定的效果，但是離工業(yè)化生產(chǎn)的要求還有一定的距離，導(dǎo)致磷脂酶C的價(jià)格比較昂貴，磷脂酶C的工業(yè)應(yīng)用受到限制。研究合適的磷脂酶C表達(dá)體系并進(jìn)行工藝優(yōu)化，對(duì)促進(jìn)磷脂酶C的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化及工業(yè)應(yīng)用具有重要的學(xué)術(shù)與實(shí)踐價(jià)值。

微生物來(lái)源的磷脂酶C結(jié)構(gòu)一般較為簡(jiǎn)單，目前已經(jīng)從多種微生物中分離得到。國(guó)內(nèi)研究起步較晚，但也取得了一定的成果，自1989年至今分別對(duì)黏質(zhì)沙雷氏武漢菌株[6]、Bacillus cereus[7]、哈維氏弧菌[8]和B. mycoide[9]產(chǎn)磷脂酶C菌株進(jìn)行了誘變、產(chǎn)酶性質(zhì)及發(fā)酵工藝等研究。國(guó)外對(duì)微生物磷脂酶C的研究起源于20世紀(jì)的60年代，多株細(xì)菌來(lái)源的磷脂酶C基因相繼被克隆并對(duì)其底物特異性、酶學(xué)性質(zhì)等進(jìn)行了較為深入的研究[10]，國(guó)內(nèi)除本課題組成功實(shí)現(xiàn)不同來(lái)源磷脂酶C的重組表達(dá)外，公開(kāi)報(bào)道的最高酶活力為26U/mL。

本課題組近年來(lái)也對(duì)磷脂酶C進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，篩選獲得了多株磷脂酶C高產(chǎn)菌株，并在國(guó)內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了B. cereus磷脂酶C基因的重組表達(dá)[10]，研究分析了Pseudomonas aeruginosa來(lái)源各磷脂酶C的特性并構(gòu)建了高產(chǎn)菌株，在LB培養(yǎng)基中的初步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)即獲得了較高酶活[11]。但是在用LB培養(yǎng)基進(jìn)行上罐發(fā)酵時(shí)，與搖瓶發(fā)酵時(shí)相比，不論是添加甘氨酸前后，總酶活力的提升幅度都較小，原因可能是LB培養(yǎng)基中菌體量無(wú)法有效增長(zhǎng)，難以高密度培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-plcH為出發(fā)菌株，進(jìn)一步在搖瓶中對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行了工藝驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-plcH，本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保藏。

p-NPPC (p-nitrophenylphosphoryl cholone，p-NPPC)美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

LB(luria-bertani)液體培養(yǎng)基；TB(terrific broth)培養(yǎng)基；TB-TH培養(yǎng)基(g/L)：稱取12g蛋白胨、24g酵母提取物和5g甘油加入到1L的Tris-HCl (0.25mol/L，pH 7.2～7.4)緩沖液中，1×105Pa高壓滅菌20min。

1.3 方法

1.3.1 酶活力的檢測(cè)

反應(yīng)體系構(gòu)成參考文獻(xiàn)[12]，酶活力單位的定義參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的比較

考察LB、TB兩種培養(yǎng)基的產(chǎn)酶情況，誘導(dǎo)方法：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)10h，次日以5%接種量轉(zhuǎn)接至50mL終質(zhì)量濃度為100μg/mL的Kana-LB或TB液體培養(yǎng)基中，37℃、150r/min培養(yǎng)4h，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，25℃、150r/min誘導(dǎo)6～10h。誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)測(cè)量發(fā)酵液OD600nm值，取等量發(fā)酵液破碎測(cè)定酶活力。

1.3.3 TB培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化

以下優(yōu)化的發(fā)酵條件為：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL，接種于裝有30mL的Kana-LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培養(yǎng)10h，然后以5%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接于若干裝有50mL的Kana-TB-TH液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4h后添加IPTG至終濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)6 h后收集細(xì)胞并破碎，酶活力測(cè)定方法同1.3.1節(jié)。

碳源的確定：按照碳源的添加量相同的原則，選擇麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、殼聚糖7種碳源分別替代TB培養(yǎng)基中的甘油，并與甘油做對(duì)比，誘導(dǎo)后根據(jù)酶活力測(cè)定結(jié)果，選擇合適的碳源。碳源添加量的確定：根據(jù)上述結(jié)果，配制含不同質(zhì)量濃度碳源的TB培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法如前所述，誘導(dǎo)后根據(jù)酶活力測(cè)定結(jié)果，選擇合適的碳源添加量。

1.3.4 重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制

1.3.4.1 搖瓶條件下重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制

取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL，接種于裝有30mL的Kana-LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min培養(yǎng)10h，然后以5% 轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接于若干裝有50mL的Kana-TB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，定點(diǎn)取樣測(cè)OD600nm值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)做該重組菌的生長(zhǎng)曲線以及比生長(zhǎng)速率曲線。

1.3.4.2 7L發(fā)酵罐中重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制

將二級(jí)種子以5%接種量接至含3L TB培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，溶氧水平偶聯(lián)攪拌轉(zhuǎn)速，使溶氧濃度保持在30%左右，pH值控制在7.2左右，培養(yǎng)溫度37℃，流加50%的甘油，在保證碳氮源充足的情況下，每隔1h取樣測(cè)定OD600nm，繪制重組菌在3L TB培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)曲線。此處TB培養(yǎng)基組分為：12g/L蛋白胨魚(yú)粉、24g/L酵母浸膏、30g/L甘油、0.1g/L卡那霉素。

1.3.5 TB-TH培養(yǎng)基條件下，添加IPTG對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)條件的初步優(yōu)化

1.3.5.1 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

根據(jù)宿主大腸桿菌適宜生長(zhǎng)的溫度范圍及實(shí)驗(yàn)室條件，在37℃培養(yǎng)至6h，并添加IPTG至終濃度1.0mmol/L后分別在不同溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。酶活力測(cè)定方法參照1.3.1節(jié)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定誘導(dǎo)溫度。

1.3.5.2 IPTG添加時(shí)間的優(yōu)化

參考TB培養(yǎng)基重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線，在接種后不同時(shí)間添加IPTG誘導(dǎo)，并誘導(dǎo)6h。取相同體積的菌體，用0.25mol/L 的Tris-HCl (pH7.2)緩沖液稀釋至相同OD600nm=2后進(jìn)行超聲波破碎，以p-NPPC法測(cè)得的酶活力的大小為參考，來(lái)確定誘導(dǎo)劑添加時(shí)間，具體操作參照1.3.1節(jié)。

1.3.5.3 IPTG 濃度的優(yōu)化

添加不同濃度梯度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。酶活力測(cè)定方法參照1.3.1節(jié)，根據(jù)結(jié)果確定誘導(dǎo)劑濃度。

1.3.5.4 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

在上述已優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，分別誘導(dǎo)不同的時(shí)間后取樣破碎，酶活力測(cè)定方法參照1.3.1節(jié)，以確定誘導(dǎo)時(shí)間。

1.3.5.5 卡那霉素添加量的優(yōu)化

在上述已優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，分別添加不同質(zhì)量濃度梯度的卡那霉素，誘導(dǎo)至1.3.6.1節(jié)所優(yōu)化時(shí)間后，取樣破碎，酶活力測(cè)定方法參照1.3.1節(jié)，確定卡那霉素的添加質(zhì)量濃度。

1.3.6 TB-TH培養(yǎng)基條件下，添加乳糖對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)條件的初步優(yōu)化

1.3.6.1 乳糖添加時(shí)間的優(yōu)化

參考TB培養(yǎng)基重組大腸桿菌生長(zhǎng)曲線，在接種后不同時(shí)間添加乳糖誘導(dǎo)，并誘導(dǎo)12h。酶活測(cè)定方法參照1.3.1節(jié)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果確定乳糖添加時(shí)間。

1.3.6.2 乳糖添加量的優(yōu)化

分別添加不同質(zhì)量濃度的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。酶活力測(cè)定方法參照1.3.1節(jié)，根據(jù)結(jié)果確定誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度。

1.3.6.3 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

在上述已優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，分別誘導(dǎo)不同的時(shí)間后取樣破碎，酶活力測(cè)定方法參照1.3.1節(jié)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果以確定誘導(dǎo)時(shí)間。

1.3.6.4 甘氨酸添加量的優(yōu)化

根據(jù)上述優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)，在添加乳糖的同時(shí)添加不同質(zhì)量濃度梯度的甘氨酸，誘導(dǎo)時(shí)間暫定為6h。誘導(dǎo)結(jié)束后分別收集發(fā)酵液上清和細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞破碎，用p-NPPC法分別測(cè)定發(fā)酵液上清和細(xì)胞破碎液上清的酶活力，根據(jù)測(cè)定結(jié)果確定甘氨酸添加量。若在TB培養(yǎng)基中，甘氨酸對(duì)重組菌產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，則繼續(xù)進(jìn)行甘氨酸添加時(shí)間、甘氨酸添加后誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，反之，則不會(huì)再繼續(xù)優(yōu)化。

1.3.7 7L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 一級(jí)、二級(jí)種子的制備

一級(jí)種子制備參照1.3.3節(jié)。

取一級(jí)種子轉(zhuǎn)接，接種至250mL三角瓶(5%轉(zhuǎn)接量)含50mL的Kana-LB培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)6h后，得到二級(jí)種子。150mL的二級(jí)種子作為7L發(fā)酵罐所用種子。

1.3.7.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌產(chǎn)酶的影響

參照重組菌生長(zhǎng)曲線，在重組菌對(duì)數(shù)期中前期流加20%的乳糖(終質(zhì)量濃度初步定為20g/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為25℃，每隔6h左右取樣，測(cè)定OD600nm和酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 TB培養(yǎng)基發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵培養(yǎng)基的成分會(huì)影響重組大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，與LB培養(yǎng)基比較：1) TB培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，成分組成更適合菌體生長(zhǎng)，可獲得更多的菌體來(lái)生產(chǎn)重組酶；2) TB培養(yǎng)基含有緩沖體系，有較強(qiáng)的pH值緩沖能力，使pH值維持在7.0左右，有利于重組大腸桿菌的生長(zhǎng)和重組酶的穩(wěn)定；3) TB培養(yǎng)基酵母膏含量明顯高于LB等其他培養(yǎng)基，文獻(xiàn)報(bào)道酵母膏對(duì)重組大腸桿菌將重組酶釋放到細(xì)胞的周知空間有明顯的促進(jìn)作用[14]。因此，本研究擬采用TB培養(yǎng)基代替LB培養(yǎng)基進(jìn)行研究。

表 1 發(fā)酵培養(yǎng)基的比較Table 1 Comparison of different fermentation media on cell density and PLC activity

由表1可知，LB培養(yǎng)基的產(chǎn)酶量明顯高于TB培養(yǎng)基，因此先選擇LB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵優(yōu)化。分析原因，可能是TB培養(yǎng)基中的高濃度磷酸鹽對(duì)磷脂酶C表達(dá)具有抑制作用[14-17]。因此擬將替換TB培養(yǎng)基中的緩沖液。在考慮緩沖液緩沖范圍及磷脂酶C和菌體的pH值耐受范圍的情況下，分別考察磷酸鹽、Tris-HCl、HEPES和無(wú)緩沖液4種情況對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，方法參照1.3.2節(jié)。

由圖1可知，磷酸鹽、Tris-HCl的緩沖能力較好，發(fā)酵液的OD600nm可以達(dá)到12左右，而添加有HEPES的發(fā)酵液的OD600nm只有5左右，無(wú)緩沖液的情況下OD600nm只有4.5左右。誘導(dǎo)時(shí)間相同的情況下，緩沖液為為Tris-HCl時(shí)，酶活力可以達(dá)到260U/mL左右；緩沖液為磷酸鹽緩沖液時(shí)，酶活力可達(dá)160U/mL左右；緩沖液位HEPES時(shí)，酶活力可達(dá)200U/mL左右；無(wú)緩沖液時(shí)，酶活力可達(dá)180U/mL左右，由此可見(jiàn)Tris-HCl緩沖液要明顯好于其他3種情況。所以初步選擇Tris-HCl作為TB培養(yǎng)基的緩沖液，并將新培養(yǎng)基命名為TB-TH培養(yǎng)基。

圖 1 TB培養(yǎng)基中緩沖液的選擇Fig.1 Choice of optimum buffer in TB medium

2.2 TB-TH培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化

圖 2 TB-TH培養(yǎng)基中碳源的選擇Fig.2 Choice of optimum carbon source in TB medium

由圖2可知，按產(chǎn)酶量從高到低排序，乳糖＞甘油＞葡萄糖＞可溶性淀粉＞殼聚糖＞麥芽糖＞蔗糖＞糊精。對(duì)含有Lac啟動(dòng)子的重組菌，由于葡萄糖降低了胞內(nèi)cAMP水平和減弱了誘導(dǎo)物的利用率，因此對(duì)其產(chǎn)酶有抑制作用[18]，與結(jié)果相符，因此葡萄糖雖是常見(jiàn)的碳源，適合菌體的生長(zhǎng)，但酶活力并不高；乳糖本身即可作為碳源又是誘導(dǎo)劑，因此酶活力最高，但是乳糖作為碳源會(huì)增加發(fā)酵成本，綜合考慮后仍然選用甘油作為碳源。

2.3 TB-TH培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度的優(yōu)化

圖 3 TB-TH培養(yǎng)基中甘油質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.3 Choice of optimum glycerin concentration in TB medium

由圖3可知，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為5g/L時(shí)，菌體產(chǎn)酶量最高，可達(dá)到260U/mL左右，因此甘油的初始質(zhì)量濃度控制在5g/L 左右。綜上所述，最終TB-TH的組分為：12g/L 蛋白胨、24g/L酵母提取物、5g/L甘油，Tris-HCl(0.25mol/L，pH 7.2～7.4)緩沖液配制。

TB-TH培養(yǎng)基作為搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的培養(yǎng)基，以期找到產(chǎn)酶量最優(yōu)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。最后在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行了工藝放大實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證是否適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4 搖瓶條件下重組菌生長(zhǎng)曲線和比生長(zhǎng)速率曲線的繪制

圖 4 搖瓶條件下重組菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of the recombination strain under shake f lask conditions

圖 5 搖瓶條件下重組菌比生長(zhǎng)速率曲線Fig.5 Specif ic growth rate curve of the recombination strain under shake f lask conditions

由圖4、5可知，0～1.5h為適應(yīng)期，1.5～24h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6h左右為對(duì)數(shù)中期。

2.5 TB-TH培養(yǎng)基中，添加IPTG對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)條件的初步優(yōu)化

2.5.1 添加IPTG時(shí)誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 6 添加IPTG時(shí)誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of IPTG induction temperature on phospholipase activity

由圖6可知，誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，重組蛋白的酶活力達(dá)到最大，可達(dá)到280U/mL左右。故選取發(fā)酵誘導(dǎo)的溫度為25℃。

圖 7 IPTG添加時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of IPTG addition time on phospholipase activity

2.5.2 IPTG添加時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響由圖7可知，在對(duì)數(shù)中期6h時(shí)添加IPTG，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大值，達(dá)到365U/mL左右。故IPTG添加時(shí)間為轉(zhuǎn)接后6 h。

2.5.3 IPTG濃度對(duì)酶活力的影響

圖 8 IPTG濃度對(duì)酶活力的影響Fig.8 Effect of IPTG concentration on phospholipase activity

由圖8可知，在IPTG濃度為0.6mmol/L時(shí)，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大，約485U/mL。故IPTG濃度選為0.6mmol/L。

2.5.4 添加IPTG時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 9 添加IPTG時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of IPTG induction time on phospholipase activity

由圖9可知，IPTG添加后20h，重組蛋白的酶活力達(dá)到最大值，可達(dá)到800U/mL左右。故誘導(dǎo)時(shí)間選為20h。

2.5.5 添加IPTG時(shí)卡那霉素質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響

由圖10可知，在卡那霉素質(zhì)量濃度為0.15mg/mL時(shí)，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大，約850U/mL。故IPTG質(zhì)量濃度選為0.15mg/mL。

圖 10 添加IPTG時(shí)卡那霉素添加量對(duì)酶活力的影響Fig.10 Effect of Kana concentration (when IPTG was added) on phospholipase activity

綜上所述，TB-TH培養(yǎng)基下，添加IPTG時(shí)，重組大腸桿菌誘導(dǎo)條件為：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL加入到30mL的Kana-LB培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)10h，次日以5%轉(zhuǎn)接量接種至50mL的TB-TH培養(yǎng)基中，添加卡那霉素的質(zhì)量濃度為0.15mg/mL，37℃、200r/min培養(yǎng)6h后，添加IPTG至終濃度為0.6mmol/L，并25℃、150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20h。在此誘導(dǎo)條件下，酶活力可達(dá)到(794.01±24.84)U/mL。

2.6 TB-TH培養(yǎng)基中，添加乳糖對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)條件的初步優(yōu)化

圖 11 乳糖添加時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.11 Effect of lactose addion time on phospholipase activity

2.6.1 乳糖添加時(shí)間的確定由圖11可知，在對(duì)數(shù)中期6h時(shí)添加乳糖，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大值，達(dá)到860U/mL左右。故乳糖添加時(shí)間為轉(zhuǎn)接后6h。

2.6.2 乳糖添加量對(duì)酶活力的影響

圖 12 乳糖質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響Fig.12 Effect of lactose concentration on phospholipase activity

由圖12可知，在乳糖質(zhì)量濃度為5g/L時(shí)，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大，約1350U/mL。故乳糖質(zhì)量濃度選為5g/L。

2.6.3 添加乳糖時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 13 添加乳糖時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.13 Effect of lactose induction time on phospholipase activity

由圖13可知，乳糖添加后22h，重組蛋白的酶活力達(dá)到最大值，可達(dá)到1422U/mL左右。故誘導(dǎo)時(shí)間選為22 h。

綜上所述，TB-TH培養(yǎng)基下，添加乳糖時(shí)，重組大腸桿菌誘導(dǎo)條件為：取保藏于甘油管中的重組大腸桿菌50μL加入到30mL的Kana-LB培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)10h，次日以5%轉(zhuǎn)接量接種至50mL的TB-TH培養(yǎng)基中，添加Kana質(zhì)量濃度至0.15mg/mL，37℃、200r/min培養(yǎng)6h后，添加乳糖至終質(zhì)量濃度為5g/L，并25℃、150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20h。在此誘導(dǎo)條件下，酶活力可達(dá)到(1422.42±37.17)U/mL。

2.6.4 甘氨酸質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響

雖然甘氨酸在很多大腸桿菌產(chǎn)重組酶的發(fā)酵過(guò)程中具有促進(jìn)重組酶分泌的作用[19-20]，由圖14可知，在TB-TH培養(yǎng)基中添加甘氨酸對(duì)重組菌酶活的提高無(wú)任何促進(jìn)作用，反而有顯著的抑制作用，因此，本研究不再對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。參考有關(guān)文獻(xiàn)[14]可得，某些滲透性物質(zhì)(例如甘氨酸)可對(duì)磷脂酶C的生產(chǎn)有抑制作用，這也較好的解釋了上述現(xiàn)象。

圖 14 甘氨酸添加量對(duì)酶活力的影響Fig.14 Effect of glycine concentration on phospholipase activity

2.7 7L分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.7.1 重組菌在7L發(fā)酵罐種生長(zhǎng)曲線的繪制

圖 15 在發(fā)酵罐中不流加甘油時(shí)，重組菌生長(zhǎng)曲線Fig.15 Growth curve of the recombination strain without the addition of glycerol in fermentation tanks

圖15為不流加50%甘油時(shí)的生長(zhǎng)曲線，重組菌在1h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)比搖瓶發(fā)酵下的生長(zhǎng)曲線(圖4)可知，重組菌的生長(zhǎng)周期比搖瓶發(fā)酵下大大縮短。在pH值和溶氧都得到較好控制的情況下，發(fā)酵的OD600nm值最高可以達(dá)到12左右，與搖瓶發(fā)酵下基本一致。

圖 16 在發(fā)酵罐中流加甘油時(shí)，重組菌生長(zhǎng)曲線Fig.16 Growth curve of the recombination strain with the addition of glycerol in fermentation tanks

圖16為流加50%甘油時(shí)的生長(zhǎng)曲線，重組菌在3h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。在碳氮源充足、pH值和溶氧都得到較好控制的情況下，發(fā)酵的OD600nm值最高可以達(dá)到70左右，比搖瓶發(fā)酵下提高了5倍左右。

綜上所述，最終選擇了流加甘油的方式進(jìn)行后續(xù)乳糖誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

2.7.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖 17 發(fā)酵罐中誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.17 Inf luence of induction time on phospholipase production in fermentation tanks

乳糖的添加時(shí)間為發(fā)酵后6h，即OD600nm為20左右時(shí)。由圖17可知，胞內(nèi)酶活在加入誘導(dǎo)劑后2h便迅速增加，在14～34h左右酶活力增長(zhǎng)趨于平緩，在62h左右酶活力達(dá)到最高，最高為(10957.97±58.03)U/mL；胞外酶活在加入誘導(dǎo)劑后25h左右迅速增加，在45h左右達(dá)到最高，最高為(645.27±13.87)U/mL；總酶活力在62h左右達(dá)到最高，達(dá)到(11583.35±70.21)U/mL，比搖瓶發(fā)酵下提高了7倍左右。

由于是在25℃誘導(dǎo)，因此菌體的生長(zhǎng)速度明顯不如在37℃培養(yǎng)時(shí)，且生長(zhǎng)周期大大延長(zhǎng)，OD600nm最大值為66左右。在14～34h左右時(shí)，酶活力增加不明顯，但是菌體量增長(zhǎng)迅速，原因可能是菌體此段時(shí)間主要進(jìn)行分裂生長(zhǎng)，即甘油的利用率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于乳糖的利用率，致使乳糖的誘導(dǎo)效率明顯降低。

與LB培養(yǎng)基相比，利用TB培養(yǎng)基在7L發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)，重組菌的酶活力提升幅度較理想，因此，如果將重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-plcH應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，TB (無(wú)緩沖液)培養(yǎng)基是較理想的培養(yǎng)介質(zhì)。

3 討 論

利用TB-TH培養(yǎng)基，對(duì)E. coli BL21(DE3)/pET28a-plcH進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化。誘導(dǎo)劑為IPTG的情況下，確定的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：5%轉(zhuǎn)接量，250mL三角瓶裝液量為50mL，卡那霉素的質(zhì)量濃度150μg/mL，37℃、200r/min培養(yǎng)6h時(shí)添加IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，25℃、150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20h，酶活力可達(dá)到(794.01±24.84)U/mL；誘導(dǎo)劑為乳糖的情況下，確定的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：5%轉(zhuǎn)接量，250mL三角瓶裝液量為50mL，卡那霉素的質(zhì)量濃度150μg/mL，37℃、200r/min培養(yǎng)6h時(shí)添加乳糖至終質(zhì)量濃度為5g/L，25℃、150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)22h，酶活力可達(dá)到(1422.42±37.17)U/mL，較IPTG誘導(dǎo)條件下提高了0.8倍。

進(jìn)一步考察了添加甘氨酸對(duì)E. coli BL21(DE3)/pET28a-plcH產(chǎn)酶的影響。結(jié)果顯示，在TB-TH培養(yǎng)基中添加甘氨酸對(duì)重組菌產(chǎn)酶量的提高無(wú)任何促進(jìn)作用，反而有顯著的抑制作用，一定程度上證實(shí)了相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，即某些滲透性物質(zhì)(例如甘氨酸)可對(duì)磷脂酶C的生產(chǎn)有抑制作用[14]，這也較好的解釋了上述現(xiàn)象。

在7L發(fā)酵罐中對(duì)E. coli BL21(DE3)/pET28a-plcH進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。在加入乳糖后2h胞內(nèi)酶活力便迅速增加，在14～34h左右酶活力增長(zhǎng)趨于平緩，在62h左右酶活力達(dá)到最高，最高為(10957.97±58.03)U/mL；胞外酶活在加入乳糖后25h左右迅速增加，在45h左右達(dá)到最高，最高為(645.27±13.87)U/mL；總酶活力在62h左右達(dá)到最高，達(dá)到(11583.35±70.21)U/mL，比搖瓶發(fā)酵下提高了7倍左右。

P. aeruginosa含有多個(gè)與編碼磷脂酶C有關(guān)的基因，基于課題組前期研究，選擇重組表達(dá)具有溶血活性的plcH的大腸桿菌BL21 (DE3)/pET28a-plcH在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行了工藝驗(yàn)證，獲得了(11583.35±70.21)U/mL的高酶活力，為下一步研究磷脂酶C的產(chǎn)業(yè)化奠定了較好的基礎(chǔ)。

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