集胞藻PCC6803中S2P蛋白酶假定底物的體外誘導(dǎo)表達(dá)及純化

秦春燕，陳 谷*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

藍(lán)細(xì)菌是一類分布廣泛、行光合作用的原核生物，被認(rèn)為是植物葉綠體的祖先。它是研究光合生物基因表達(dá)調(diào)控的模式生物[1]，其脅迫響應(yīng)機(jī)理一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。當(dāng)脅迫壓力超過(guò)一定的閾值時(shí)，生物體會(huì)感知環(huán)境變化并將脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域以調(diào)控響應(yīng)基因的表達(dá)，通過(guò)激活一系列響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄、合成特定蛋白、生成特定代謝物來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫。這個(gè)過(guò)程涉及跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。藍(lán)細(xì)菌基因組中包含9個(gè)σ因子[3]，不同的σ因子的替換被認(rèn)為是應(yīng)對(duì)環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)變化改變基因表達(dá)模式的關(guān)鍵。其中SigG、SigH、SigI的功能未知，但被推斷為胞外功能σ因子(ECF σ)[3]。細(xì)菌中的研究發(fā)現(xiàn)大部分負(fù)責(zé)響應(yīng)胞外刺激和脅迫壓力的ECF σ因子，其活力受到相對(duì)應(yīng)并共轉(zhuǎn)錄的跨膜anti-σ因子結(jié)合抑制，在外界壓力脅迫條件下，金屬蛋白酶S2P(Site-2-Protease)在膜切割anti-σ因子跨膜區(qū)域解除對(duì)σ因子的抑制，啟動(dòng)一系列σ因子識(shí)別基因的轉(zhuǎn)錄[4-5]。

集胞藻PCC6803中有4個(gè)S2P同源蛋白：Sll0862、Slr0643、Sll0528、Slr1821[6]，但其功能撲朔迷離。在此前的研究中發(fā)現(xiàn)，弱酸脅迫響應(yīng)條件下(pH6.5)，slr0643缺失突變體Δslr0643與野生型(wild type，WT)相比生長(zhǎng)停滯，提示Slr0643可能參與這一脅迫響應(yīng)過(guò)程[7]，sll0862缺失突變體在氧化和熱脅迫響應(yīng)中出現(xiàn)異常[8]，但其作用機(jī)理及底物均未明確。通過(guò)系統(tǒng)考察各個(gè)物種中S2P作用機(jī)理和底物特征，并深入分析集胞藻PCC6803的9個(gè)σ因子及anti-σ因子，發(fā)現(xiàn)了幾對(duì)σ因子和anti-σ因子的組合：SigE-ChlH(Slr1055)[9]、SigI(Sll0687)-Sll0688、SigG(Slr1545)-Slr1546及SigH(Slr0856)-Sll0857。這些anti-σ因子是否作為S2P底物被S2P剪切，從而介導(dǎo)脅迫信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)呢？這是個(gè)非常有趣的問(wèn)題。此外，文獻(xiàn)報(bào)道S2P對(duì)底物的剪切發(fā)生在S1P切割之后，且S2P剪切底物的效率受底物(跨膜蛋白anti-σ因子)的羧基端氨基酸影響[10]。例如，在體外大腸桿菌S2P蛋白酶(RseP)不能直接切割其底物RseA全長(zhǎng)，但能有效切割其底物的截短片段RseA△(1～140)[10-12]。

故而通過(guò)體外重組系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)并純化幾個(gè)可能的S2P底物，包括全長(zhǎng)及截去羧基端部分序列的截短片段：Slr1055及Slr1055△(1～232)、Sll0688及Sll0688△(1～152)、Slr1546及Slr1546△(1～174)、Sll0857及Sll0857△(1～101)和RseA(1～148)[10]，為構(gòu)建體外酶切體系，驗(yàn)證S2P與anti-σ因子之間酶與底物的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

集胞藻PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803) 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；大腸桿菌(Escherichia coli)DH10B、BL21(CE3) 日本TaKaRa公司；pET-30b(+)質(zhì)粒 美國(guó)Novagen公司。

1.1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)Marker 加拿大Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、質(zhì)粒DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒 日本TaKaRa公司；DNA Marker 廣州東盛生物科技有限公司；Ni-IDA蛋白純化樹(shù)脂 美國(guó)Novagen公司；胰蛋白胨、酵母粉、乳糖、IPTG、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基二乙胺 美國(guó)Sigma公司；PCR儀iCycle、電泳裝置 美國(guó)Bio-Rad公司；UV2300紫外分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0；32Y培養(yǎng)基：酵母粉32g/L、胰蛋白胨8g/L、甘油0.5%、NaCl 100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L(pH7.6)；M9培養(yǎng)基：Na2HPO430g/L、KH2PO415g/L、 NH4Cl 5g/L、葡萄糖2g/L、硫胺素500μg/L。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 引物合成

在Cyanobase數(shù)據(jù)庫(kù)中(http：//genome.kazusa.or.jp/cyanobase/ Synechocystis)獲取slr1055、slr0688、slr1546、slr0857及其片段基因序列，采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司合成。

表 1 PCR擴(kuò)增所用的引物Table 1 PCR primers used for DNA amplification

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用改進(jìn)的CTAB法提取集胞藻PCC6803基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：0.5μL PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、10μL PCR Buffer(Mg2+plus)、4μL dNTPs、1μL基因組模板，上下游引物各1μL(10μmol/L)，ddH2O補(bǔ)足體積至50μL。反應(yīng)條件：94℃、3min，98℃、10s，58℃、15s，72℃、2min，72℃、5min。反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，取5μLPCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒

將PCR產(chǎn)物和pET-30b(+)載體經(jīng)相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切，回收目的基因和載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶22℃、10min連接后再經(jīng)16℃連接過(guò)夜，取連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH10B。次日挑取單克隆，利用快速篩選法、PCR驗(yàn)證、質(zhì)粒雙酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆，并送上海英駿生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行DNA測(cè)序，鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pF1055(CG80-A/CG80-B)、pF1055△(CG80-A/Q7)、pF0688(CG92-A/CG92-B)、pF0688△(CG92-A/Q4)、pF1546(CG93-A/CG93-B)、pF1546△(CG93-A/Q5)、pF0857(Q6-A/Q6-B)、pF0857△(Q6-A/Q6)、pFRseA(CG94-A/CG94-B)。

1.3 集胞藻6803中S2P蛋白酶假定底物的誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

1.3.1 Slr1055及Slr1055△、Sll0688及Sll0688△、Slr1546及Slr1546△、Sll0857及Sll0857△和RseA(1～148)誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確的重組質(zhì)粒p F 1 0 5 5、p F 1 0 5 5 △、pF0688、pF0688△、pF1546、pF1546△、pF0857、pF0688△、pFRseA均轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21(CE3)，鋪至含50μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培養(yǎng)皿上，次日，挑選單菌落，接種至5～10mL含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。按照1%接種量將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接種至10mL含相應(yīng)抗生素的不同培養(yǎng)基(LB、32Y、M9)中，待菌液生長(zhǎng)至A600nm至1.0左右時(shí)，加入IPTG或α-乳糖至不同的終質(zhì)量濃度，不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜。取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，以誘導(dǎo)前的菌液作為對(duì)照，進(jìn)行同樣操作。

1.3.2 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

收集100mL誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，加入10mL結(jié)合緩沖液(0.5mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl、5mmol/L咪唑，pH7.9)，冰浴超聲裂解細(xì)胞(工作3s，間隔3s，功率250W)至澄清透明，4℃收集菌體，16100×g離心20min，收集上清經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值至7.9。用IDA His Bind樹(shù)脂直接純化上清中的目的蛋白，用不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析檢測(cè)濃度和分子質(zhì)量，純化蛋白樣品保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖 1 重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart of the construction of recombinant plasmids

以表1相應(yīng)的引物從集胞藻PCC6803基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)的目的基因并連接到pET-30b(+)載體中，構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。用快速篩選法篩選陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR及酶切鑒定(圖2)。鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行了測(cè)序鑒定，確保目的片段正確插入pET-30b(+)中。

圖 2 重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的鑒定Fig.2 Identifi cation of recombinant plasmids

2.2 集胞藻PCC6803中S2P假定底物誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

2.2.1 RseA重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

圖 3 重組蛋白R(shí)seA的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Induced expression of putative substrates of RseA

由于大腸桿菌中S 2 P 蛋白酶R s e P 底物的R s e A (1～148)是大腸桿菌體內(nèi)的蛋白，表達(dá)過(guò)程中容易被體內(nèi)蛋白酶降解，故其誘導(dǎo)表達(dá)具有一定難度。實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)IPTG濃度、培養(yǎng)基及溫度等條件的優(yōu)化，成功誘導(dǎo)出RseA蛋白(圖3A、B)。并得到RseA最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：32Y培養(yǎng)基中添加0.2mmol/L IPTG在22℃條件下誘導(dǎo)10h(圖3B泳道2)。

2.2.2 Slr1546△重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

圖 4 重組蛋白Slr1546Δ的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.4 Induced expression of putative substrates of Slr1546Δ

由圖4可知，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)Slr1546△重組蛋白的表達(dá)影響較大，最優(yōu)表達(dá)條件為L(zhǎng)B培養(yǎng)基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)10h以上(泳道5、6)。

2.2.3 Sll0688△重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

圖 5 重組蛋白Sll0688Δ的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.5 Induced expression of putative substrates of Sll0688Δ

由圖5可知，在LB、32Y培養(yǎng)基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)8h以上Sll0688△重組蛋白均可得到高效表達(dá)。

2.2.4 Sll0857與Sll0857△重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

圖 6 重組蛋白Sll0857及Sll0857Δ的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.6 Induced expression of putative substrates of Sll0857 and Sll0857Δ

由圖6可知，Sll0857 and Sll0857△重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件為：32Y培養(yǎng)基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)8h以上。

2.2.5 Slr1546與Sll0688重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

圖 7 重組蛋白Slr1546及Sll0688的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.7 Induced expression of putative substrates of Slr1546 and Sll0688

由圖7可知，在32Y培養(yǎng)基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)8h以上，Slr1546及Sll0688重組蛋白均能得到有效表達(dá)。

2.2.6 Slr1055與Slr1055△重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

圖 8 重組蛋白Slr1055及Slr1055Δ的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.8 Induced expression of putative substrates of Slr1055 and Slr1055Δ

由圖8可知，在32Y培養(yǎng)基中添加0.4mmol/L IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)8h以上，Slr1055及Slr1055△重組蛋白均能得到有效表達(dá)。

2.3 S2P假定底物的誘導(dǎo)表達(dá)

圖 9 S2P假定底物的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.9 Induced expression of putative substrates of site-2-proteases

由上述實(shí)驗(yàn)可知，成功誘導(dǎo)表達(dá)了各個(gè)假定底物：Slr1055及Slr1055△(1～232)、Sll0688及Sll0688△(1～152)、Slr1546及Slr1546△(1～174)、Sll0857及Sll0857△(1～101)。

2.4 集胞藻PCC6803中S2P假定底物的表達(dá)純化

之前對(duì)△slr0643(slr0643缺失突變體)與野生型的弱酸脅迫響應(yīng)差異進(jìn)行了基因芯片分析[6]，發(fā)現(xiàn)Slr0643很可能通過(guò)基因簇sll0856-sll0857-sll0858，控制Sigma因子(σH，Sll0856)的表達(dá)，即Slr0643/Sll0857/SigH通過(guò)S2P/antisigma factor/sigma factor 的級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式調(diào)控酸脅迫下基因的轉(zhuǎn)錄[6]。因此首先重點(diǎn)純化了Sll0857以及其片段Sll0857△，得到純度較高的重組蛋白，如圖10所示。

圖 10 重組蛋白Sll0857、Sll0857Δ的表達(dá)純化Fig.10 Purifi cation of Sll0857 and Sll0857Δ

而后用最優(yōu)條件誘導(dǎo)表達(dá)，并純化了幾個(gè)可能的底物全長(zhǎng)及片段：Slr1055及Slr1055△(1～232)、Sll0688及Sll0688△(1～152)、Sll1546及Sll1546△(1～174)、RseA，如圖11所示。

圖 11 S2P假定底物的純化Fig.11 Purifi cation of putative substrate of site-2-protease

3 討 論

前期工作已經(jīng)成功證實(shí)集胞藻PCC6803中的S2P蛋白酶Slr0643和Sll0862參與多種脅迫響應(yīng)[14-16]，但是揭開(kāi)它們的具體機(jī)制有賴于找到S2P的底物。此前成功在體外重組表達(dá)了Slr0643及Sll0862，并揭示它們能在體外切割β-Casein[6]具有蛋白酶活性。本研究通過(guò)系統(tǒng)考察各個(gè)物種中S2P作用機(jī)理和底物特征，深入分析集胞藻PCC6803的9個(gè)σ因子及anti-σ因子，鎖定了4對(duì)σ因子和anti-σ因子的組合：SigE-ChlH(Slr1055)[9]、SigI(Slr0687)-Sll0688、SigG(Slr1545)-Slr1546及SigH(Slr0856)-Sll0857。通過(guò)構(gòu)建于pET載體，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，成功地獲得8個(gè)S2P假定底物：包括全長(zhǎng)的anti-σ因子及其截?cái)嗟钠巍?/p>

近年來(lái)，光合生物S2P的功能頗受關(guān)注。例如，AMOS1/EGY1介導(dǎo)了擬南芥應(yīng)答銨鹽脅迫的響應(yīng)，并與脫落酸信號(hào)調(diào)控通路相關(guān)，參與維持銨鹽脅迫下葉綠體的完整結(jié)構(gòu)和功能[17]。但其具體的機(jī)理卻有待揭開(kāi)S2P的底物才能完整解釋。依據(jù)其他生物體中S2P的研究結(jié)果，在正常生長(zhǎng)條件下，σ因子被anti-σ因子束縛在膜上，無(wú)法識(shí)別并與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，故其無(wú)法調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)脅迫信號(hào)刺激啟動(dòng)S2P級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，anti-σ因子將先后被S1P和S2P剪切，釋放所束縛的σ因子到核區(qū)，啟動(dòng)其調(diào)控的基因簇轉(zhuǎn)錄。迄今為止，鎖定集胞藻PCC6803中的4對(duì)σ因子和anti-σ因子的組合，是光合生物研究中的首個(gè)關(guān)于S2P底物的研究。通過(guò)重組表達(dá)純化4個(gè)anti-σ因子及其截短片段，下一步將在體外重構(gòu)S2P與假定底物之間的酶切體系，考察酶與底物的相互關(guān)系。當(dāng)然，集胞藻PCC6803中4個(gè)S2P蛋白酶：Sll0862、Slr0643、Sll0528、Slr1821均含有多個(gè)跨膜區(qū)域、導(dǎo)致其表達(dá)純化非常困難。下一步實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)純化這4個(gè)S2P蛋白酶的條件，獲取更多有活性的蛋白酶，來(lái)構(gòu)建體外酶切體系，為闡釋藍(lán)藻體內(nèi)S2P介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供進(jìn)一步證據(jù)。

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