發(fā)酵芝麻粕中芝麻小肽的分離純化及其體外抗氧化活性

彭惠惠，李呂木,,,*，錢 坤，許發(fā)芝，吳 東，周 芬，丁小玲

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽 合肥 230036；3.安徽省畜牧生物工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230031)

芝麻屬胡麻科胡麻屬，在亞洲廣泛種植，榨油后的副產(chǎn)物麻渣或餅粕中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為38%～50%，芝麻蛋白中氨基酸含量豐富。大量研究證實蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)并不是全部以單個氨基酸形式被吸收，部分是以小肽的形式被吸收，且小肽被吸收的效果要比氨基酸好[1]，同時小肽還具有特殊的生物活性功能如抑制血壓升高[2]、抗疲勞[3]、增強免疫功能[4]及降低膽固醇[5]等作用，而這些作用均與其抗氧化性質(zhì)有關(guān)。芝麻蛋白經(jīng)蛋白酶水解后，酶解物具有體外抗氧化活性，在質(zhì)量濃度為1mg/mL時，對·OH、超氧陰離子自由基都有明顯的清除作用[6]。在微生物固態(tài)發(fā)酵芝麻粕以提高其飼用品質(zhì)的過程中也產(chǎn)生了一定量的小肽[7]，但這種小肽是否也具有很好的抗氧化活性，尚未見文獻報道。為此，本實驗選取枯草芽孢桿菌和乳酸菌混菌發(fā)酵的芝麻粕為原料，研究其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的小肽的抗氧化能力，為芝麻小肽在食品、飼料等領(lǐng)域內(nèi)的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發(fā)酵芝麻粕：枯草芽孢桿菌和乳酸菌混菌接種比例1：1，菌種由安徽農(nóng)業(yè)大學飼料科技研究所提供，接種量8%，30℃固態(tài)厭氧發(fā)酵14d，小肽含量7.13%。

藍色葡聚糖-2000、L-酪氨酸、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽 北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-15 北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

752紫外-可見分光光度計 上海浦東物理光學儀器廠；DHL-A電腦恒流泵、HD-21-1核酸蛋白檢測儀、SBS-100自動液相色譜層析儀 上海青浦滬西儀器廠；層析柱(2.6cm×60cm) 上海錦華層析設備廠；多功能有機膜實驗設備 合肥世杰膜工程有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 芝麻小肽粗提

稱10g發(fā)酵芝麻粕加100mL純水150r/min浸提30min，溶液過0.45μm濾膜后，用1000D納濾膜過濾，取分子質(zhì)量小于1000D部分濃縮待測。

1.2.2 芝麻小肽分離純化

采用Sephadex G-15凝膠層析柱對芝麻小肽粗體液進行分離純化。用pH7.0雙蒸水洗脫，樣品質(zhì)量濃度為70mg/mL，上樣量為lmL，流速為0.5mL/min，檢測波長為280nm。

1.2.3 標準曲線繪制

凝膠層析組分小肽分子質(zhì)量測定用藍色葡聚糖-2000測定外體積V0，用鉻酸鉀測總體積Vt。分別用L-酪氨酸(M=181.19)、還原型谷胱甘肽(M=307.32)、氧化型谷胱甘肽(M=612.6)上柱，層析柱(2.6cm×60cm)，洗脫液為雙蒸水，上樣量為lmL，洗脫流速0.5mL/min，檢測波長280nm，得出標準蛋白的洗脫體積Ve。計算得到系數(shù)Kav=(Ve－V0)/(Vt－V0)。以標準蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量的對數(shù)(lgM)為橫坐標，系數(shù)Kav為縱坐標，作標準曲線。用芝麻小肽粗提液代替標準蛋白，按照標準曲線的制作方法操作，得出洗脫體積，重復測定1～2次，取洗脫體積的平均值。從標準曲線的方程算出樣品的分子質(zhì)量。

1.2.4 小肽含量測定

采用Lowry-福林酚法[8]，重復測定2次。

1.2.5 DPPH自由基清除作用的測定[9]

準確稱取20mg DPPH用無水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液。利用DPPH溶液的特征紫紅色團波長517nm的吸收峰，測定加入樣品后A517nm吸收的下降表示其對有機自由基的清除能力。

取2mL不同質(zhì)量濃度的樣品液，加入2mL 2×10-4mol/L (0.1mmol/L)的DPPH無水乙醇溶液，混勻，室溫避光反應30min后測定波長517nm處的吸光度Ai，同時測定2mL DPPH+2mL乙醇的吸光度A0和2mL樣品液+ 2mL乙醇混合后的吸光度Aj。重復測定2次。計算DPPH自由基的清除率。

1.2.6 ·OH清除作用的測定[10]

在10mL試管中依次加入6mmol/L硫酸亞鐵溶液 2.0mL，不同質(zhì)量濃度的小肽溶液2.0mL，6mmol/L雙氧水溶液2.0mL，搖勻后靜置10min，再加入6mmol/L水楊酸溶液2.0mL，搖勻后靜置30min后于波長510nm處測定其吸光度。重復測定2次。

式中：A0為不加樣品液的本底吸光度；As為加入樣品溶液反應后的吸光度；Ax為不加水楊酸溶液酶解液的吸光度。

1.2.7 還原力測定[11]

具塞試管中依次加入0.5mL小肽溶液、2.5mL 0.2mol/L PBS磷酸緩沖液(pH6.6)、2.5mL 1.0% K3(Fe(CN)6)，迅速混勻，50℃水浴中反應20min，冰水冷卻并加2.5mL 10%三氯乙酸(TCA)，混勻后以3000r/min離心10min。取2.5mL上清液，加2.5mL雙蒸水和0.5mL 0.1%三氯化鐵，混勻，測定各樣品在700nm波長處的吸光度。用蒸餾水作為無還原能力對照。重復測定2次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

用藍色葡聚糖-2000測定外體積V0=41.8mL，用鉻酸鉀測總體積Vt=76.1mL，L-酪氨酸(M=181.19)、還原型谷胱甘肽(M=307.32)、氧化型谷胱甘肽(M=612.6)的洗脫體積分別為91.65、67.20、44.51mL。擬合得到回歸方程：y =－0.3841x + 2.802，回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.9904，說明lgM與Kav線性相關(guān)。

2.2 Sephadex G-15檢測芝麻小肽的相對分子質(zhì)量分布

芝麻小肽粗提液經(jīng)過Sephadex G-15凝膠色譜柱分離，得到了3個峰，如圖1所示，各個峰的洗脫體積分別是41.69、57.13、73.07mL，代入標準曲線擬合的方程，得到酶解物中3個組分的分子質(zhì)量分布為：636、426、282D，即芝麻小肽粗體液分離得到的3個組分為六肽、四肽、三肽。經(jīng)凝膠柱分離小肽回收率達到60.2%，將收集的3個組分的洗脫液進行冷凍存放，待進一步分析。

圖 1 芝麻小肽Sephadex G-15柱層析洗脫圖譜Fig.1 Elution profi le of sesame peptide on Sephadex G-15

2.3 芝麻小肽對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基清除能力可以很好表達對于油溶性自由基的清除能力。DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若小肽能清除它，則小肽具有打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應的作用[12]。由圖2可知，在高質(zhì)量濃度(mg/mL)條件下小肽粗提液的DPPH自由基清除率高于2,6-二叔丁基- 4-甲基苯酚(BHT)，經(jīng)SAS軟件分析知，差異極顯著(P＜0.01)；但在低質(zhì)量濃度(0.1mg/mL)條件下，小肽粗提液的DPPH自由基清除率與BHT差異不顯著。表明芝麻小肽可以作為高效抗氧化劑。

圖 2 芝麻小肽粗提液與BHT清除DPPH自由基能力的比較Fig.2 Scavenging capacity of sesame peptide and BHT on DPPH free radicals

由圖3可知，芝麻小肽粗提液及分離得到的各肽組分均具有清除DPPH自由基的能力，并且在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基清除率呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在低質(zhì)量濃度下，三肽的抗氧化活性最強；四肽抗氧化性與芝麻小肽粗提液抗氧化能力接近；六肽的抗氧化性最弱。在高質(zhì)量濃度下，三肽、四肽和粗提液的DPPH自由基清除率均接近90%。初步可以推斷對于質(zhì)量濃度相同、分子質(zhì)量不同的小肽而言，清除DPPH自由基的能力隨著小肽分子質(zhì)量的減小而增大。上述結(jié)果與Chen等[13]的研究一致，肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量大小密切相關(guān)。這主要是因為抗氧化活性肽含有某些能與自由基反應的特殊基團即供氫基團，只有當小肽在適當分子質(zhì)量時，這些特殊的供氫基團才能得到最大的暴露充分與自由基作用，此時才具有較強的抗氧化性。

圖 3 芝麻小肽清除DPPH自由基能力的比較Fig.3 Scavenging capacity of sesame peptide on DPPH free radicals

2.4 芝麻小肽對·OH的清除作用

圖 4 芝麻小肽清除·OH能力的比較Fig.4 Scavenging capacity of sesame peptide on hydroxyl free radicals

由圖4可知，芝麻小肽在實驗質(zhì)量濃度(0.1～1mg/mL)范圍內(nèi)對·OH均有清除作用，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，小肽的抗氧化活性也隨之增強，小肽中含有供氫體，具有提供質(zhì)子的能力，使具有高度氧化性的自由基還原，從而達到終止自由基連鎖反應，起到清除或抑制自由基的目的，因此，隨著質(zhì)量濃度的增加，供氫體增多，提供質(zhì)子的能力增強，其抗氧化性也就會隨之提高。凝膠層析分離所收集的各組分中，三肽和四肽組分清除·OH最強，清除率達到100%，粗提液和六肽清除率均達到90%。

2.5 芝麻小肽還原力

樣品還原力的大小可通過測定其吸光度的大小反映出來，吸光度越大則其還原力越強。由圖5可知，芝麻小肽在實驗質(zhì)量濃度(0.5～5mg/mL)范圍內(nèi)總還原力與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系?？寡趸瘎┦峭ㄟ^自身的還原作用給出電子而消除自由基的[14]，因此還原力越強，其抗氧化性越強。隨著小肽質(zhì)量濃度的增加，小肽的抗氧化性也隨之增強；凝膠層析分離所收集的各組分中，組分3(三肽)的還原力最強，這一結(jié)果與清除DPPH自由基、·OH活性一致。還原型谷胱甘肽作為對照，其總還原力高于芝麻小肽各組分。4mg/mL的小肽粗提液、四肽、六肽，2mg/mL三肽和0.5mg/mL谷胱甘肽的吸光度相同，說明這些物質(zhì)的總還原力相當。

圖 5 芝麻小肽總還原力的比較Fig.5 Total reducing power of sesame peptide

·OH等自由基誘導的氧化損傷被認為是引起細胞損傷、死亡、癌變，組織傷害和衰老的原因之一。因此尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是關(guān)注的課題。目前，國內(nèi)對芝麻肽的研究集中于酶解芝麻蛋白，由于使用單一的酶，得到的芝麻肽活性較低。本實驗研究微生物固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)生的芝麻肽的抗氧化活性，綜合以上3種抗氧化實驗數(shù)據(jù)分析可以看出，在不同的實驗體系中，分子質(zhì)量最小的三肽抗氧化能力最強，雖然在水系中芝麻三肽總還原力低于谷胱甘肽，但在油系中芝麻小肽清除DPPH自由基活力高于BHT，因此芝麻小肽在油脂抗氧化方面值得今后深入研究。芝麻肽具有較強的還原力，對·OH和DPPH自由基均具有較強的清除作用，且抗氧化性隨著芝麻肽分子質(zhì)量的降低而增強，可見芝麻肽的抗氧化活性與芝麻肽的分子質(zhì)量存在相關(guān)關(guān)系。抗氧化肽的抗自由基能力可能與其氨基酸組成和順序有關(guān)[15]，芝麻抗氧化肽富含供氫體，具有提供質(zhì)子的能力，可以使具有高度氧化性的自由基還原，從而終止自由基鏈式反應，起到清除或抑制自由基的目的。這些都可能是芝麻肽具有較強抗氧化作用的原因之一，但其詳細的抗氧化機理和構(gòu)效關(guān)系還需要進一步研究。

3 結(jié) 論

固態(tài)發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)生的三肽、四肽和六肽均具有抗氧化活性，且抗氧化性隨著小肽分子量的降低而增強。芝麻小肽作為一種天然抗氧化劑，安全無毒副作用，在食品、飼料等領(lǐng)域有廣泛的應用前景。

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