干酪乳桿菌LC2W原生質(zhì)體的制備與再生

黃 茜，杜昭平，馬成杰，潘能慶，劉 蕾，馬愛民,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海 200436)

乳酸菌作為基因工程菌表達外源蛋白時不會產(chǎn)生內(nèi)毒素[1]，而且經(jīng)改造后去除質(zhì)粒的乳酸菌菌株基本不表達本源蛋白[2]，這些優(yōu)點使其非常適合作為外源基因表達的宿主菌，所以乳酸菌食品級表達系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用受到了研究者的重視。隨著研究的深入，糖誘導(dǎo)表達系統(tǒng)、pH值誘導(dǎo)表達系統(tǒng)、溫度敏感表達系統(tǒng)、乳鏈球菌素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)、噬菌體φ3l爆發(fā)式誘導(dǎo)表達系統(tǒng)等乳酸菌表達系統(tǒng)被逐步建立[3-6]，并成功表達了人干擾素β、HPV-16 E7蛋白以及白細胞介素等多種外源物質(zhì)[7-9]。

乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，具有厚且致密的細胞壁，載體DNA轉(zhuǎn)化并進入受體細胞難度較大。相對于常規(guī)化學(xué)方法和電轉(zhuǎn)化法，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法設(shè)備條件要求較低、方法簡單、結(jié)果可靠，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。原生質(zhì)體的制備與再生是實現(xiàn)乳酸菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的技術(shù)關(guān)鍵[10]，近年來，已有關(guān)于保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌及瑞士乳桿菌等乳酸菌原生質(zhì)體制備、再生及融合方面的研究報道[11-14]。

作為一種被公認為安全的(generally regarded as safe，GRAS)食品級微生物，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)及其微生態(tài)制品日益受到國內(nèi)外的重視，不但應(yīng)用于益生菌發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，而且成為食品級基因克隆和高效外源表達系統(tǒng)研究與開發(fā)的熱點[15-17]。L. casei LC2W(CGMCC No.0828)在模擬人體消化環(huán)境中具有較強的耐受性和優(yōu)異的存活性能，降高血壓等益生功能明顯，具備較強的應(yīng)用開發(fā)潛力[18]。本實驗通過對影響L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的因素以及原生質(zhì)體再生的條件進行研究，以期為L. casei LC2W食品級表達系統(tǒng)的構(gòu)建和菌種改良提供前期的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

L. casei LC2W(冷凍干燥菌粉) 光明乳業(yè)股份有限公司；MRS培養(yǎng)基 德國Merck公司。

原生質(zhì)體制備液：0.2mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液(PBS)，含0.8mol/L甘露醇[19]；原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基(不含吐溫-80)中添加以下物質(zhì)(g/L)：明膠25.0、蔗糖171.2、氯化鈣2.8、氯化鎂5.0、胎牛血清(BSA)5.0、瓊脂15.0～18.0[20]。

1.1.2 酶與試劑

溶菌酶(用PBS配制成所需的不同質(zhì)量濃度梯度的酶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用) 韓國Biosharp公司；其他化學(xué)試劑(分析純) 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5415R臺式離心機 德國Eppendorf公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SA-300VF高壓蒸汽滅菌器 德國Sturdy Industrial公司；Specteumlab22可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；Bactron-Ⅰ厭氧培養(yǎng)箱 美國Shellab公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將適量L. casei LC2W冷凍干燥菌粉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接活化2～3次后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 L. casei LC2W生長曲線測定[10]

以1%的接種量向新鮮MRS液體培養(yǎng)基中接種L. casei LC2W活化菌液，于37℃靜置培養(yǎng)，每隔2h取樣一次，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為參比，測定樣品在600nm波長處的光密度(OD)值。

1.3.3 L. casei LC2W原生質(zhì)體制備[20]

取對數(shù)生長期的菌液，用無菌生理鹽水梯度稀釋至合適稀釋度，取0.1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃倒置厭氧培養(yǎng)(48±2)h，計菌落數(shù)(A)。

取同時期菌液1mL于無菌離心管中，4000r/min離心5min，用原生質(zhì)體制備液洗滌2次，收集菌體，加入1mL一定濃度的酶液，保溫一定時間，4000r/min離心5min，用PBS洗滌1次，然后再用1mL的滅菌的去離子水重懸菌體并靜置10min，得到原生質(zhì)體懸液。

取上述原生質(zhì)體懸液1mL，經(jīng)無菌PBS緩沖液梯度稀釋至合適梯度后，取0.1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃倒置厭氧培養(yǎng)(48±2)h，計菌落數(shù)為未形成原生質(zhì)體菌落數(shù)(B)。

1.3.4 L. casei LC2W原生質(zhì)體再生[20]

取上述原生質(zhì)體懸液1mL，用無菌PBS緩沖液稀釋至合適稀釋度后，取0.1mL涂布于再生培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)(48±2)h，計菌落數(shù)為酶解后再生菌落數(shù)(C)。

1.3.5 單因素試驗確定影響原生質(zhì)體形成率的因素

菌齡：分別取在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6、8、10、12、14h的菌體，在溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解溫度37℃、酶解時間30min的條件下制備原生質(zhì)體，計算原生質(zhì)體形成率。

溶菌酶質(zhì)量濃度：收集在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h的菌體，分別用1、5、10、15、20mg/mL的酶液，在酶解溫度37℃、酶解30min的條件下制備原生質(zhì)體，計算原生質(zhì)體形成率。

酶解時間：收集在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h的菌體，在溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解溫度37℃的條件下制備原生質(zhì)體，分別在酶解15、30、45、60、75、90min時取樣，計算原生質(zhì)體形成率。

酶解溫度：收集在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h的菌體，在溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL，分別在20、28、37、42、50℃的酶解溫度下，酶解30min，制備原生質(zhì)體，計算原生質(zhì)體形成率。

1.3.6 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用不同菌齡、溶菌酶質(zhì)量濃度、酶解時間和酶解溫度設(shè)計四因素三水平正交試驗，以此來優(yōu)化干酪乳桿菌原生質(zhì)體的制備條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. casei LC2W的生長曲線

圖 1 L. casei LC2W在MRS液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of L. casei LC2W in MRS broth

由圖1可知，L. casei LC2W在MRS液體培養(yǎng)基中生長時，5h后進入對數(shù)生長期，OD600nm值上升較快；15h左右進入穩(wěn)定期，OD600nm值達到最大并基本維持穩(wěn)定；20h后進入衰亡期，菌液OD600nm值開始下降。

2.2 菌齡對原生質(zhì)體形成率的影響

制備原生質(zhì)體時，一般選擇對數(shù)生長期的菌體，這主要是由于對數(shù)生長期細菌代謝旺盛，細胞壁肽聚糖含量最低，細胞壁對酶的作用最敏感，但處于對數(shù)生長早期的菌體細胞相對脆弱，受酶的過度作用會影響原生質(zhì)體的再生率[20]。因此，本實驗選取處于對數(shù)生長中后期的菌體細胞進行原生質(zhì)體制備與再生，各菌齡下的原生質(zhì)體形成率如圖2所示。當菌齡低于10h時，原生質(zhì)體形成率隨菌齡增加而升高，菌齡為10h時原生質(zhì)體形成率最高，達到95.24%；隨著菌齡的增加，對數(shù)生長后期的細胞代謝水平與活力下降，對酶的敏感性逐漸降低，原生質(zhì)體形成率也就隨之下降。

圖 2 菌齡對L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.2 Effect of cell age on protoplast preparation of L. casei LC2W

由于處于不同生長時期的菌體生理狀態(tài)不同，因此各時期的細胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體的代謝水平及菌體的活力也都不同。L. casei LC2W菌株對數(shù)生長中期的菌體細胞對溶菌酶的敏感性最高，孫磊等[21]的研究結(jié)果表明，具有最高轉(zhuǎn)化效率的細胞處于對數(shù)生長中期，韓璞等[10]的結(jié)果也驗證了此觀點，因此選取該時期菌齡(8～12h)的細胞進行后續(xù)研究。

2.3 溶菌酶質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體形成率的影響

圖 3 不同溶菌酶質(zhì)量濃度對L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.3 Effect of lysozyme concentration on protoplast preparation of L. casei LC2W

溶菌酶質(zhì)量濃度對L. casei LC2W菌體原生質(zhì)體形成率的影響見圖3，當酶質(zhì)量濃度為1mg/mL時，原生質(zhì)體的形成率僅為5.21%；隨著酶質(zhì)量濃度的升高，L. casei LC2W原生質(zhì)體形成率也不斷增加，當酶質(zhì)量濃度為15mg/mL時，形成率達到最大值85.08%；當酶質(zhì)量濃度進一步升高時，原生質(zhì)體形成率略有降低，該結(jié)果與韓璞等[10]對羅伊氏乳桿菌原生質(zhì)體及張莉滟等[11]對保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體的制備和再生結(jié)果一致。

分析認為，溶菌酶質(zhì)量濃度較低時，對L. casei LC2W菌體細胞壁作用不完全，原生質(zhì)體形成率不高；酶質(zhì)量濃度的升高增加了酶分子與細胞壁接觸的機會，使得細胞壁被水解的幾率增大；當溶菌酶質(zhì)量濃度超過最佳處理質(zhì)量濃度時，酶已處理完全，不再形成原生質(zhì)體；而酶質(zhì)量濃度過高時，在細胞壁水解完全后，可能會進一步水解細胞膜上的部分蛋白成分引起細胞失活，甚至破裂，從而導(dǎo)致原生質(zhì)體形成率降低[22-23]。因此，適宜的溶菌酶質(zhì)量濃度是影響原生質(zhì)體制備的重要因素之一，本研究采用10、15、20mg/mL溶菌酶質(zhì)量濃度進行正交試驗。

2.4 酶解時間對原生質(zhì)體形成率的影響

圖 4 不同酶解時間對L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on protoplast preparation of L. casei LC2W

溶菌酶酶解時間對L. casei LC2W菌體原生質(zhì)體形成率的影響如圖4所示。隨著酶解時間的延長，L. casei LC2W原生質(zhì)體形成率隨之升高；當酶解時間達到75min時，原生質(zhì)體形成率最高為62.47%；但當酶解時間延長至90min時，原生質(zhì)體形成率反而有所降低，僅為60.38%。

適宜的酶解時間是制備原生質(zhì)體的重要條件。不同的微生物的最適酶解時間差異很大，仲松等[24]制備干酪乳桿菌ZZ-L原生質(zhì)體的最佳酶解時間為110min，王玉華等[12]制備嗜酸乳桿菌的最佳酶解時間為90min。酶解時間過短，酶對細胞壁作用不徹底，原生質(zhì)體制備率不高；酶解時間過長將導(dǎo)致原生質(zhì)體皺縮，容易造成原生質(zhì)體活性降低，甚至會損害細胞質(zhì)膜導(dǎo)致再生率急劇下降[22]。本研究選取60、75、90min 3個酶解時間進行正交試驗。

2.5 酶解溫度對原生質(zhì)體形成率的影響

溶菌酶酶解溫度對L. casei LC2W菌體原生質(zhì)體形成率的影響如圖5所示。當酶解溫度從20℃升至42℃時，L. casei LC2W原生質(zhì)體形成率逐漸增加；當酶解溫度達到42℃時，原生質(zhì)體形成率最高達85.71%；而酶解溫度繼續(xù)升高時，原生質(zhì)體形成率反而迅速下降。

圖 5 不同酶解溫度對L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on protoplast preparation of L. casei LC2W

研究表明[25]，最適酶解溫度都要略高于微生物的最適生長溫度。在低于最適酶解溫度時，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體制備率不斷提高；高于最適酶解溫度時，由于細胞活性和酶活性都會受到高溫的影響，原生質(zhì)體的制備率也必然會受到影響。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取37、42、50℃ 3個酶解溫度進行正交試驗。

2.6 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗確定的菌齡、溶菌酶質(zhì)量濃度、酶解時間和酶解溫度梯度，進行L9(34)正交試驗，結(jié)果如表1所示。

表 1 正交試驗優(yōu)化原生質(zhì)體制備條件Table 1 Results of orthogonal tests for optimizing protoplast formation of L. casei

由表1可知，極差分析結(jié)果表明，影響L. casei LC2W原生質(zhì)體形成的4因素主次順序為：A＞D＞B＞C，即菌齡＞酶解溫度＞溶菌酶質(zhì)量濃度＞酶解時間。L. casei LC2W原生質(zhì)體制備最佳條件為A1B1C2D2，即菌齡8h、溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解時間75min、酶解溫度42℃，按此優(yōu)化條件進行驗證實驗，重復(fù)3次，取平均值，得原生質(zhì)體形成率為97.15%。

2.7 L.casei LC2W原生質(zhì)體的再生

經(jīng)優(yōu)化條件制備的L.casei LC2W原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，菌落形態(tài)如圖6所示，呈圓形，表面濕潤光滑，乳白色，不透明。在此優(yōu)化條件下，L.casei LC2W原生質(zhì)體再生率為31.25%。

圖 6 L. casei LC2W原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.6 Colony morphology of L. casei LC2W protoplast in regeneration medium

3 結(jié) 論

作為我國衛(wèi)生部2010年公布的可用于食品的益生菌菌種之一，干酪乳桿菌的安全性優(yōu)勢越來越受到研究者的青睞，成為食品級外源蛋白表達系統(tǒng)的研究熱點。干酪乳桿菌細胞壁中肽聚糖含量較高，不利于進行各種分子生物學(xué)操作，而使用去除細胞壁的原生質(zhì)體作為實驗材料，可以提高基因工程操作的工作效率[26]。L. casei LC2W具備良好的益生功能和開發(fā)潛力，開展L. casei LC2W的原生質(zhì)體制備與再生條件的研究可以為L. casei LC2W的食品級外源表達系統(tǒng)的研究提供相關(guān)基礎(chǔ)，具有一定的實際意義和基礎(chǔ)應(yīng)用價值。

本實驗對影響L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的因素進行了分析和優(yōu)化，并確定最佳制備條件為：菌齡8h、溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解時間75min、酶解溫度42℃，在此條件下，原生質(zhì)體的形成率達到97.15%，再生率為31.25%。

[1] 阮孟斌, 朱明月, 周鵬. 外源基因在乳酸菌中的表達[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2004, 10(4)： 526-529.

[2] JOHANSEN E. Challenges when transferring technology from Lactococcus laboratory strains to industrial strains[J]. Genetics and Molecular Research, 2003, 2(1)： 112-116.

[3] HO P S, KWANG J, LEE Y K. Intragastric administration of Lactobacillus casei expression transmissible gastroenteritis coronavirus spike glycoprotein induced specific antibody production[J]. Vaccine, 2005, 23(11)： 1335-1342.

[4] El DEMERDASH H A, HELLER K, GEIS A. Application of the shsp gene, encoding a small heat shock protein, as a food grade selection marker for lactic acid bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(8)： 4408-4412.

[5] NEU T, HENRICH B. New thermosensitive delivery vector and its use to enable nisin controlled gene expression in Lactobacillus gasseri[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(3)： 1377-1382.

[6] ZHOU Xuxia, LI Weifn, MA Guoxia. The nisin-controlled gene expression system： construction, application and improvements[J]. Biotechnology Advances, 2006, 24(3)： 285-295.

[7] 王瑩, 胡桂學(xué). 食品級乳酸菌表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(7)： 80-82.

[8] ZHUANG Zhong, WU Zhigang, CHEN Min, et al. Secretion of human interferon-β 1b by recombinant Lactococcus lactis[J]. Biotechnology Letters, 2008, 30(10)： 1819-1823.

[9] CORTES-PEREZ N G, BERMúDEZ-HUMáRAN L G, Le LOIR Y, et al. Mice immunization with live lactococci displaying a surface anchored HPV-16 E7 oncoprotein[J]. FEMS Microbiology Letter, 2003, 229(1)： 37-42.

[10] 韓璞, 田洪濤, 苑社強, 等. 羅伊氏乳桿菌原生質(zhì)體的制備與再生條件的研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2010, 10(1)： 10-18.

[11] 張莉滟, 陳林, 張德純. 保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體的制備與回復(fù)研究[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2004, 16(2)： 73-74.

[12] 王玉華, 張桂榮, 劉景圣. 原生質(zhì)體融合提高嗜酸乳桿菌耐酸及耐膽鹽能力[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(3)： 96-99.

[13] 賈建波, 陳軍, 時號. 乳酸菌融合菌株的構(gòu)建及其特性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(21)： 309-311.

[14] 羅紅霞, 陳志剛, 黃彥芳, 等. 原生質(zhì)體融合技術(shù)選育弱后酸化乳酸菌菌株的研究[J]. 中國乳品工業(yè), 2010, 38(1)： 8-11.

[15] 魏春華, 劉建奎, 侯喜林, 等. 重組ETEC k88ac-LTB干酪乳桿菌在人工消化液中的生存性能[J]. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(1)： 43-48.

[16] XU Yigang, LI Yijing. Construction of recombinant Lactobacillus casei efficiently surface displayed and secreted porcine parvovirus VP2 protein and comparison of the immune responses induced by oral immunization[J]. Immunology, 2008, 124(1)： 68-75.

[17] CHEN H L, LAI Yiwen, CHEN Chuashun. Probiotic Lactobacillus casei expressing human lactoferrin elevates antibacterial activity in the gastrointestinal tract[J]. Biometals, 2010, 23(3)： 543-554.

[18] 吳正鈞. 干酪乳桿菌LC2W菌體的抗高血壓作用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2011, 23(2)： 228-231.

[19] PATNAIK R, LOUIE S, GAVRILOVIC V, et al. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance[J]. Nature Biotechnology, 2002, 20(7)： 707-712.

[20] 曾獻春, 孟冬麗. 乳酸菌原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10)： 269-272.

[21] 孫磊, 孔文濤, 孔健. 乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化條件的研究[J]. 山東大學(xué)學(xué)報： 理學(xué)版, 2005, 40(3)： 121-124.

[22] 仝千秋. 保加利亞乳桿菌生物學(xué)特性及原生質(zhì)體制備的研究[D]. 鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[23] 邱靜, 羅水忠, 姜紹通, 等. 高產(chǎn)L-乳酸米根霉的原生質(zhì)體制備與再生條件研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(9)： 174-178.

[24] 仲松, 張慶慶, 孫平平. 紫外誘變原生質(zhì)體選育高產(chǎn)L-乳酸菌株的研究[J]. 安徽工程大學(xué)學(xué)報, 2011, 26(1)： 28-30.

[25] 李秀珍, 楊平平, 王燕. 黑曲霉原生質(zhì)體誘變育種技術(shù)研究進展[J]. 中國釀造, 2007(12)： 1-5.

[26] 谷偉, 錢方. 乳酸菌的生物工程育種[J]. 食品科技, 2007, 32(1)： 4-7.